（2014版）
寧波大學海洋學院
2014.09
目錄實驗一乳酸菌的分離與初步篩選實驗
實驗二乳酸菌的初步鑑定實驗
實驗三乳酸菌菌種保藏實驗
實驗四乳酸菌的培養與發酵實驗
實驗五乳酸菌發酵產物的分析與測定
實驗六發酵罐操作訓練
實驗一乳酸菌的分離與初步篩選實驗
一、 實驗目的及要求
1、 掌握從環境樣品中分離所需微生物的一般操作
2、 掌握平板劃線分離菌種的原理和操作方法
3、 掌握利用透明圈法獲得單菌落菌株的原理。
二、 實驗原理
自然樣品中存在混雜的微生物，通過選擇性培養基及樣品稀釋使形成細胞分散液，再通過固體培養基在合適的培養條件下培養形成單菌落，由此得到分離的純培養菌株。乳酸菌最基本的代謝特性是發酵產酸，待分離樣品在合適的培養基和培養條件下，乳酸菌在特定設計的培養基中由於生長產酸產生溶鈣形象，從而在培養基中產生透明圈，透明圈直徑大小可反映菌落生長產酸量的大小，而不是乳酸菌或不產生酸積累的細菌不能產生透明圈。
三、 實驗器材
1、 待用分離樣品（醃菜，各種泡菜，酸奶，植物汁液，等）；
2、 培養基：mrs培養基或改良乳酸菌分離培養基；無菌水；
3、 器皿與裝置：培養皿、移液管、試管、三角瓶、接種環、塗佈棒、超淨工作台、天平、取樣瓶，培養箱，等。
四、 方法和步驟
1、 分離樣品的採集
取樣須知：結合乳酸菌菌種特性（文獻資料查閱），獲取乳酸菌在自然界或相關產品等的分布規律，設計樣品採集範圍。
採集樣品經適當儲存或立即處理。
2、 菌種的分離
稱採樣品5g或5ml 加到45ml無菌水的三角瓶中（30℃恆溫處理20分為佳）充分**後（含玻璃珠）使其自然沉澱用1ml移液管吸取上清菌懸液1ml至9ml無菌水試管中依次進行10倍稀釋至10-4~10-5用移液管吸取1ml菌懸液至含碳酸鈣的mrs培養基平板中，塗佈均勻30℃恆溫培養2~3天觀察菌落，分別挑取生長良好的含透明圈的可疑乳酸菌單菌落，分別移接至普通乳酸菌培養基的斜面試管，菌種編號，30℃恆溫培養1~2天，長菌後在4℃冰箱儲存待用。
五、 實驗結果
1、 在培養平板中觀察各菌落生長情況，仔細觀察可疑乳酸菌的菌落形態，大小，色澤，透明圈等特徵，運用所學微生物知識初步確定其屬於哪個菌屬。
2、 記錄，選取，並標記，斜面移接和培養，待用。
六、 思考題
1、 閱讀文獻資料後設計你的取樣方案並說明理由？目的是最大可能篩選分離得到乳酸菌。
2、 產酸性微生物分離篩選的一般步驟？
寫作實驗報告
附培養基配方及製備方法
含碳酸鈣的mrs培養基（分離實驗），除去碳酸鈣即得斜面培養基。
配方如下：蛋白腖 10g，牛肉膏 10g，葡萄糖 20g，酵母膏 5g，檸檬酸氫二銨2g，mgso4.7h2o 0.
58g， mnso4.4h2o 0.25g，乙酸鈉5g，吐溫-80 1ml，caco3 20~30g，瓊脂 15g，蒸餾水 1000ml，ph6.
8。（液體培養基則不加瓊脂）。（注：
目前已有合成的mrs培養基）
配製方法：將各成分按配方比例溶解，冷卻至50℃，以鹽酸、或醋酸或氫氧化鈉調節ph為6.8左右，分裝三角瓶，按量加入1.
5%瓊脂，121℃滅菌20min，備用。caco3分開滅菌用時加入。
乳酸菌生長培養基或斜面儲存培養基，成分同mrs培養基配方（去除caco3）。
實驗二乳酸菌的初步鑑定實驗
一、 實驗目的
1、 了解菌種初步鑑定基本方法
2、 掌握乳酸菌鑑定的基本方法
二、 實驗原理
對實驗一得到的經初步判定為乳酸菌的純培養物，進一步通過其形態或生物學特性進行分析或測定，根據乳酸菌鑑定相關手冊加以比較，初步鑑定得出分離菌株的種屬型別。
三、 實驗器材
顯微鏡，簡單染色液（美藍、結晶紫、鹼性複紅，等），95%乙醇，。
其它同實驗一
四、方法與步驟
1、菌落形態觀察：
在固體培養基中培養後形成的菌落，觀察形態（如菌落大小，邊緣形狀，隆起程度，等）；並作好記錄。
2、細胞形態觀察：
通過簡單染色法或革蘭氏染色法觀察細胞形態，或g+及g-特點。
方法：簡單染色法流程塗片→乾燥→固定→染色→水洗→乾燥→鏡檢
革蘭氏染色法流程塗片→乾燥→固定→染色（初染→媒染→脫色→復染）→鏡檢。
其它：生理生化鑑定或pcr分子鑑定（待用）
建議增加碳源利用實驗（試紙條）
五、實驗結果與分析
1．菌落形態觀察結果。
2．細胞形態觀察結果。
六、問題（作業）：
乳酸菌的基本生物學特性？
實驗三乳酸菌菌種保藏實驗
一、 實驗目的
了解菌種保藏基本原理與掌握菌種保藏方法
二、 實驗原理
對實驗二得到的經初步判定為乳酸菌的純培養物進行菌種保藏。
菌種保藏原理：在低溫、缺氧環境等條件下，抑制微生物的生命活動但不致死，使微生物長期儲存生命活力且不死亡。
三、 實驗器材
甘油，冰箱，超低溫冰箱；其它同實驗一
四、方法與步驟
1. 斜面低溫保藏法：將現有的菌種接入空白斜面培養基中，在合適培養條件下培養，得到生長旺盛的菌種時，做好標記，置於4℃冰箱保藏。
2. 冷凍保藏法：從試管斜面取2~3環菌苔於5ml mrs液體培養基中，培養過夜（10~14h）即為對數生長中期至後期細菌，將5ml 菌液8000 rpm離心1 min收穫菌體沉澱，棄上清；用600μl新鮮mrs液體培養基重新懸浮所收穫的細胞；加入400μl滅菌的50％甘油，混勻，使甘油終濃度為20%；分裝入冷凍指管或安瓿中，於-80℃超低溫冰箱中保藏。
五、實驗結果與分析
菌種保藏結果分析
六、問題（作業）：
菌種保藏基本原理？不同方法的區別點？
實驗四乳酸菌的培養與發酵實驗
一、實驗目的
1、 了解菌種培養所需條件
2、 掌握幾種常見接種技術
3、 掌握兼性好氧發酵培養操作技術
二、實驗原理與內容
靜置培養：根據物件微生物的好氧特性採用的培養方式。由微生物的營養要求（決定培養基營養組成）及培養特性（溫度ph要求），設計培養條件，在適宜的培養條件下進行微生物的生長與代謝活動，最後達到實驗設計所需要的目的。
實驗內容：微生物接種培養與發酵；微生物生物量的測定；微生物代謝變化初步分析（酸度測定）。
三、實驗器材
1、 乳酸菌發酵培養基：同實驗一。
2、 器皿：超淨工作台、接種環、記號筆，培養箱，台式離心機，等。
3、 菌種：取自實驗一分離培養的乳酸菌。
四、實驗步驟與方法
1、 將通過鑑定與保藏的待試驗菌種乳酸菌經無菌操作接種到乳酸菌斜面培養基中，然後將其置於30℃恆溫培養箱中恆溫培養1~2d，得新鮮斜面種子待用。
2、 配製液體培養基（用於液體培養的mrs培養基）或實驗一預先準備好。培養基體積50ml左右為宜，8層紗布包住瓶口，包紮，以取代一般的棉塞，滅菌同前。
3、 接種（1瓶/人）：用接種環從斜面上蘸取少許菌苔，在錐形瓶內靠近液面的瓶壁處將菌苔輕輕研磨並輕輕振盪，或將接種環直接在培養基內振搖幾次即可，一般接種2~3環。
也可先製備液體種子液，用移液管根據接種百分比接種種子。
4、 將錐形瓶置於培養箱中靜置培養，30℃下培養1~2d，放瓶。
5、 發酵產物基本測定：酸度（可用ph計），生物量測定（取一定量發酵液，放入相應大小離心管，經高速離心後（10000轉/分，5分）沉澱，傾去上清液，稱重菌體重量，計算溼密度；或將菌體烘乾，測定細胞乾重，得到細胞幹物質量。
五、實驗結果及思考題
1. 觀察試驗菌在液體培養基中的細胞群體形態，描述試驗菌的生長規律（特性），並記錄與分析。
2. 通過計算ph變化值，分析乳酸菌生長代謝變化特點或規律。
3. 計算細胞生物量值，根據生物量的變化分析細胞生長的特點（如生物週期等）。
實驗五乳酸菌發酵產物的分析與測定
一、目的和要求
1. 了解並初步掌握一般細菌發酵培養產物的定性定量分析測定方法。
2. 學習薄層層析法對乳酸的定性定量測定一般操作及方法。
二、實驗原理與內容
實驗原理：
薄層層析是一種廣泛應用於氨基酸、多肽、核苷酸、有機酸和生物鹼等多種物質的分離和鑑定的層析方法。由於層析是在吸附劑或支援介質均勻塗佈的薄層上進行的，所以稱之為薄層層析。
薄層層析的主要原理是：根據樣品組分與吸附劑的吸附力及其在展層溶劑中的分配係數的不同而使混合物分離。當展層溶劑移動時，會帶著混合樣品中的各組分一起移動，並不斷發生吸附與解吸作用以及反覆分配作用。
根據各組分在溶劑中溶解度不同和吸附劑對樣品各組分的吸附能力的差異，最終將混合物分離成一系列的斑點。如果把標準樣品在同一層析薄板上一起展開，便可通過在同一薄板上的已知標準樣品的rf值和未知樣品各組分的rf值進行對照，就可初步鑑定未知樣品各組分的成分。
薄層層析根據所支援物的性質和分離機制的不同包括吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾等。
實驗內容：
發酵培養液酸度的測定，以乳酸%計。（同實驗三）
乳酸定性定量：薄層層析法，比色法測定等（選學）
三、實驗器材
1.實驗材料：實驗二發酵液、矽膠g層析板（或紙層析：濾紙），0.3%和0.7%%乳酸；等
2.實驗試劑：
展層溶劑（1）：正丁醇：甲酸：水=80：15：5（v/v/v）；顯色劑：3%的溴甲酚綠酒精溶液。（為本次試驗所使用的展層溶劑）
展層溶劑（2）（備用）：乙醇：濃氨水：
水=80：5：15（v/v/v）；顯色劑：
0.04%的溴甲酚紫酒精溶液（稱取適量的溴甲酚紫，用50%的乙醇溶液溶解後，再用0.1n naoh溶液調ph=8）
3、器皿：燒杯、玻璃板（8cm×12cm）、層析缸（ 15cm×30cm）、毛細管( 0.5mm)、玻棒、噴霧器、烘箱、尺、鉛筆、乾燥器
四、實驗方法與過程
1、發酵液的預處理
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