臨床基因擴增檢驗實驗室工作規範

主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查，評價結果必須有書面報告。對於「熱啟動」技術(在第乙個高溫變性步驟後加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應混合液中。

在整個本區的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，並經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是乙個有效地防止汙染的措施。

嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經高壓處理。

工作結束後必須立即對工作區進行清潔。本工作區的實驗台表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗台表面的紫外照射應方便有效。

由於紫外照射的距離和能量對去汙染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成後調至實驗台上60～90em 內照射。由於擴增產物僅幾

百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，最好是照射過夜。實驗室及其裝置的使用必須有日常記錄。

(二)標本製備區

下述操作在該區進行：臨床標本的儲存，核酸(rna、dna)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定rna時edna的合成。

要正確使用加樣器。由於在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的汙染，所以應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠汙染。

為避免樣本間的交叉汙染，加入待測核酸後，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程式。

用過的加樣器吸頭必須放人專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表面每次工作後都要清潔，實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺，則必須分別處理並作出記錄。

對實驗台適當的紫外照射(254nm波長，與工作檯面近距離)適合於滅活去汙染。可移動紫外線管燈可用來確保工作後對實驗檯面的充分照射。

樣本處理對核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。

用於rna擴增檢測的樣本製備好以後，應立即進行cdna合成，因為cdna鏈較rna穩定，儲存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要，應在標本製備區設定乙個以上的溫育裝置。

cdna合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向於使用一步法：即使用在擴增反應緩衝液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的dna聚合酶進行逆轉錄，其較cdna合成後再開蓋以調節緩衝液或加入聚合酶進行擴增發生汙染的可能性降低。

待測rna的cdna拷貝須儲存在標本製備區，不得在本區對樣本進行pcr擴增。

(三)擴增區

下述工作在本區內進行：dna或cdna擴增。此外，已製備的dna模板和合成的cr)na(來自樣本製備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和製備區)製備成反應混合液等也可在本區內進行。

在巢式pcr測定中，通常在第一輪擴增後必須開啟反應管，因此巢式擴增有較高的汙染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。

不能從本區再進人任何「上游」區域，可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。

為避免氣溶膠所致的汙染，應儘量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超淨台內進行。開啟預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。

乙個簡單的方法是在開啟反應管前快速離心數秒。可使用體積較小的離心機，因其所佔實驗檯面小，易於用乙隻手操作，適合於大多數超淨臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防汙染作用，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續性的汙染源。

用過的加樣器必須注意清潔消毒。