前言近些年來，葉綠素螢光技術已經逐漸成為植物生理生態研究的熱門方向。螢光資料是植物光合效能方面的必要研究內容。目前這種趨勢由於葉綠素螢光檢測儀的改進而得到發展。
然而螢光理論和資料解釋仍然比較複雜。就我們所了解的情況來看，目前許多研究者對螢光理論不是很清楚，儀器應用僅僅限於簡單的資料說明的基礎上，本文在此基礎上，目的在於簡單明晰地介紹相關理論和研究要點，以求簡單明確地使用葉綠素螢光檢測裝置，充分分析實驗資料，重點在於植物生理生態學技術的應用和限制。
螢光測量基礎
植物葉片所吸收的光的能量有三個走向：光合驅動、熱能、葉綠素螢光。三個過程之間存在競爭，其中任何乙個效率的增加都將造成另外兩個產量的下降。
因此，測量葉綠素螢光產量，我們可以獲得光化學過程與熱耗散的效率的變化資訊。儘管葉綠素螢光的總量很小(一般僅佔葉片吸收光能總量的1-2%)，測量卻非常簡單。螢光光譜不同於吸收光譜，其波長更長，因此螢光測量可以通過把葉片經過給定波長的光線的照射，同時測量發射光中波長較長的部分光線的量來實現。
有一點需要注意的是，這種測量永遠是相對的，因為光線不可避免會有損失。因此，所有分析必須把資料進行標準化處理，包括其進一步計算的許多引數也是如此。
調製螢光儀的出現是螢光研究技術的革命性的創新。在這類儀器中，測量光源是調製(高頻率開關)的，其檢測器也被調諧來僅僅檢測被測量光激發的螢光。因此，相對的螢光產量可以在背景光線(主要是指野外全光照的條件下)存在的條件下進行測量。
目前絕大多數的螢光儀採用了調製系統，同時也強烈建議選擇調製螢光儀(kate maxwell,2000)。
為什麼螢光產量會發生改變？kautsky效應和beyond
葉綠素螢光產量的變化最早在2023年被kautsky和其合作者發現。他們發現，當把植物葉片從黑暗中轉入光下，螢光產量瞬間上公升(大約在1秒左右)這種上公升可以解釋為光合途徑中電子受體的還原(可接受電子的受體的減少)。一旦psii吸收光能，初級電子受體qa(質體醌)接受了電子，它將不能再接受電子，直到它把電子傳遞給下一級電子載體qb。
此期間，反應中心是關閉的，反應中心關閉的比例導致光化學效率的整體下降，進而造成螢光產量的增長。
當葉片從黑暗條件轉入光下，psii(光系統2)反應中心逐漸關閉，這造成了葉綠素螢光產量(1秒鐘之內)的上公升，在此之後，螢光產量開始下降，持續大約幾分鐘或幾十分鐘，這種現象，被稱為螢光淬滅。首先，電子被從psii傳遞走的速率開始上公升，這是由於光誘導對c代謝酶的活化和氣孔開放的活化，這種淬滅被稱為光化學淬滅。同時，能量轉化為熱能的效率也提高了，這種過程被稱為「非光化學淬滅」(npq)。
典型植物中，這兩個過程變化將在15-20分鐘內完成並達到穩定狀態。當然這種時間在不同的植物種類之間差異明顯。
螢光訊號分析
為了通過葉綠素螢光產量的測量來獲得植物光合效能的有用資訊，我們有必要區分光化學過程與非光化學過程對淬滅的貢獻的差異。通常的方法是關閉兩者之一，尤其是光化學過程，這樣我們就可以測量另外一種情況的影響。傳統的方法是加入化學物質，如敵草隆(dcmu)，這種物質抑制psii活動，從而把光化學降到零。
現在的方法是「加光」 技術，即它允許光化學淬滅的貢獻瞬時減低到零。這種方法中，使用了高光強的短持續時間的光線(光脈衝，一般在0.8秒左右)，這種方法可以在瞬間關閉psii反映中心。
假如這種閃光脈衝時間足夠短的話，沒有非光化學淬滅的發生，同時也沒有誘導光化學效率的長期變化，那麼在閃光期間，此時的螢光產量相當於沒有光化學淬滅時達到的最大螢光(fm)。如果我們把光照下螢光穩定狀態(fs)和活化光不存在下螢光產量的數值(fo)相比較，我們就得出了光化學淬滅效率(可以理解為psii的效能)的資訊。
隨著光化學效率的變化，熱耗散(非光化學效率)效率也發生了改變，這取決於多種內部和外部因素。這種變化可以通過fm值的變化來體現，和光化學淬滅不同，我們不可能阻斷熱耗散的發生，因此不可能測量非光化學淬滅不存在的時候葉綠素螢光的產量。因此，所有非光化學淬滅的估計嚴格對應於暗適應點(fmo)。
由於這個原因，我們有必要設計這樣一種實驗，通過這種實驗，我們可以估計暗適應的非脅迫的參考點。這種需求是野外條件(通常估計fm的黎明前的值)的主要限制。
淬滅分析
測量過程可以通過圖1來很好地解釋。測量開始時首先開啟測量光，測量最小螢光訊號(fo)，然後給乙個強閃光，測量暗適應狀態的最大螢光(fmo)。緊接著，開啟活化光進行持續光照(或者利用野外自然光線進行照射)，並且每隔乙個間隔，重複一次飽和閃光照射，通過這個過程，光照下的最大螢光fm』可以測量到。
閃光之前的穩態螢光稱為fs，閃光後，關掉活化光(同時給乙個瞬時的遠紅外光線照射)可以測量fo』。
圖1 典型螢光測量順序
表1 通常使用的螢光引數
光化學過程
光化學淬滅引數總是和fm』和fs的值相關的。最有用的資訊是psii光化學效率(psii)。這個引數測量了與psii相關的葉綠素吸收的光用於光化學過程的比例。
它可以提供線性電子傳遞的速率測量(整個光合的指示)。在實驗室條件下，這個引數與c固定的效率有顯著的線性關係，然而這兩個引數在一定的脅迫條件下會存在差異，這是由於光呼吸速率或pseudocyclic電子傳遞速率的改變。由於psii是psii光化學的量子產量，它可以用於計算線性電子傳遞速率(j)，因此，光合速率可以描述為：
j=psii×pfda×0.5
這裡pfda是吸收的光強(molm-2s-1)，0.5是在psii和psi之間能量的分配係數。另外乙個廣泛應用的引數是光化學淬滅qp。
儘管與psii很相似，但是qp是psii反應中心開放的比例，相反1-qp是反應中心關閉的比例。psii和qp都和fv/fm(psii內稟效率，即所有psi反應中心全部開放)相關聯。fv/fm=(fm-fo)/fm=psii/qp。
qp的變化由於飽和光導致的反映中心的關閉。fv/fm的變化是由於非光化學淬滅的效率的變化。暗適應的fv/fm反應了潛在的psii的量子效率，可以用於植物光合能力的靈敏的指示，絕大多數植物在0.
83左右。低於此值將說明植物處於脅迫，尤其是光抑制現象。
qp和fv/fm估計的困難在於需要估計測量時的fo值。在實驗室中，這通常可以通過遮擋植物葉片和遠紅外光線照射幾秒種。後者可以確保所有psii反應中心迅速開放。
然而在野外的條件下，遮光仍然存在困難，一般是通過黑布瞬時遮光並同步提供遠紅外光線照射。
非光化學過程
需要暗適應的問題在量化非光化學淬滅時依然存在。需要測量fm的暗適應值。這個值在實驗室通常採取24小時的暗適應，而且在實驗開始之前不能存在任何脅迫。
這個過程是為了獲得光化學效率最大，熱耗散最小的fm的參考值。可以在黎明前測量fm值並用做參考值，黎明前fv/fm的變化可以說明環境脅迫對植物的影響。量化非光化學淬滅的最直接的方法是fm的改變除以fm的值：
npq=(fmo-fm』)/fm』
npq和熱耗散線性相關，其範圍大致在0-具體的數字。在乙個典型植物中，在飽和光強下大致在0.5-3.
5之間。這取決於物種和植物以前的經歷過程。qn是非光化學淬滅的比較傳統的(老的)術語，有的時候也會被用到。
它的範圍在0-1之間，因此在淬滅較高時不很敏感。同樣的淬滅在參考點淬滅較高時可能會表現為很小的上公升，因此直接的比較不很明確。通常，如果暗適應的fv/fm明顯不同，那麼npq也不能直接進行比較。
一般而言，非光化學淬滅的增長可能是由於葉片為免受光破壞的保護機制。研究此過程的一種方法是照光後弛豫的速率。不同的過程有不同的弛豫速率。
其時間範圍從幾分鐘到幾個小時。這些不同過程的弛豫(relaxation)動力學用於區分他們。
絕大多數條件下，對npq的主要貢獻，是高能狀態淬滅(也被成為qe)，也被認為在保護葉片免受光誘導破壞的過程中是必須的。當葉片轉入黑暗時，高能狀態淬滅在幾分鐘內弛豫。第二個過程稱為狀態轉化，範圍為幾分鐘(qt)。
狀態轉化涉及捕光蛋白可逆磷酸化過程，被認為在低光條件下平衡光能在psi和psii之間的分配中非常重要。這兩種形式不容易通過弛豫動力學中分離出來。然而qt通常只對整個淬滅起到很小的貢獻而且僅在低光下存在。
一般認為，幾分鐘內的弛豫過程都被認為是蛋白磷酸化過程。
較長時間尺度的弛豫過程通常歸因於光抑制(qi)。為更好地理解快速與慢速淬滅的貢獻，我們需要進行弛豫分析來測量。實驗中，淬滅執行弛豫，在固定間隔內測量fm的值，間隔選擇非常重要，因為，必須保證前一次閃光在間隔期內被充分弛豫。
一般而言，5分鐘的間隔是充足的，整個弛豫的持續時間在45-60分鐘之間。在此基礎上做圖，橫座標是時間，縱座標是fm。資料點可以推斷至活化光被關閉的時間。
如果在光下僅存在慢速弛豫淬滅，就可以計算 fm(fmr)的值。慢速和快速弛豫淬滅可以通過以下公式計算：
npqs=(fmo-fmr)/fmr
npqf=(fmo/fm』)-(fmo/fmr)
npq的程度和組分已經被成功用於研究不同基因型和不同表現型之間光保護和光抑制的差別。研究表明，基因型之間在npq方面存在差異。在高光生長下和低光條件下不同生態型的qe更高。
這樣的測量過程在野外不可能實現，一般方法是在關閉光源2-5分鐘後單一的閃光來用於估計fmr。5分鐘後，可能快速弛豫仍然存在，所以此時會造成npqf的低估和npqs的高估。而在野外條件下30分鐘後的閃光可以給出足夠的fmr的估計。
fmr稱為可恢復的最大螢光產量。它的獲得是在活化光誘導達到光下最大螢光平穩時，關閉活化光，測量fo』後，把飽和光的閃光延長到180秒/次。得到一組逐漸增大的最大螢光產量，將該組最大螢光產量放在半對數座標系中即成直線，該直線在y軸上的截距即為fmr。
以(fm-fmr)/ fmr可以反映不可逆的非光化學淬滅產率，即發生光抑制的可能程度。
螢光誘導動力學
用於分析葉片從黑暗中轉入光下造成的螢光上公升動力學。此種方法的優點主要在於他可以使用比較廉價的非調製螢光儀。這種研究方法目前還存在爭議，需要更多的理論支援。
葉綠素螢光的研究範圍
葉綠素螢光可以給出光系統2的狀態資訊。它可以說明光系統2使用葉綠素吸收能量的程度和它被過量光線破壞的程度。這看起來好象只對那些對光系統2感興趣的專家才有意義，其實它對於植物生理學家更有意義。
通過光系統2的電子流動在許多條件下很明顯是整個光合的速率。它提供我們在其他方法無法實現的情況下，快速估計植物光合能力的潛在能力。光系統2也被認為是光合機構中對光誘導破壞最為脆弱的部分。
光系統2的破壞是植物葉片脅迫的最早的表現。當然，螢光技術本身也不是沒有侷限的，螢光的最強有力的應用不是單獨使用這一技術，而是結合其他技術，尤其是氣體交換，從而獲得植物對環境響應的完整說明。
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