1. 病毒tcid50檢測
tcid50 是指組織培養物（細胞）半數致死劑量。它有幾個性質我們必須明白：1）它表示的是計量，不是濃度； 2）它是乙個單位；3）它的值等於1，實際上問它的值等於多少是乙個沒有意義的問題，就像問km的值等於多少一樣，如果非要說出的的值等於多少，那我們只能說它的值在任何情況下都等於1。
理解這三個性質對於理解tcid50非常重要，但是這三個性質經常被誤解，所以導致對tcid50的理解出現偏差。
首先我們來看一下這個表示法的意思：病毒滴度為108.2tcid50/ml 。
它表示的是每ml病毒溶液裡含有108.2個tcid50的病毒，這和氯化鈉的濃度為4.5mol/l表示每l溶液中含有4.
5個mol的氯化鈉是一樣的道理。經常可以聽到人說我的病毒的tcid50是這個說法是不科學的，應該說我這個溶液裡含有個tcid50的病毒或者說我這個溶液的病毒滴度是10xxtcid50/ml。也可以說病毒的tcid50效價是
tcid50=10^5.64/0.1ml。
即：將病毒懸液作10^5.64稀釋後，接種細胞0.
1ml，可以使50%的細胞產生cpe。（將病毒懸液作10^5.64稀釋後，0.
1ml中含1個tcid50，作其他一些實驗時（如中和試驗），一般常用100tcid50/0.1ml或者100tcid50/0.05ml）
本方法的優缺點:①.優點:出現陽性結果時間較短,且較明顯;②.缺點:有時候,在用槍頭吸出細胞生長液時,容易出現汙染;
使用本方法時的注意事項:①.稀釋病毒時,每做乙個病毒稀釋度都需要換槍頭,減少濃度誤差;
②.96孔板,每孔接種的細胞量:一般在此種測定病毒滴度的方法下,要將細胞密度適當調低,至少要比正常傳代時低一些,否則細胞生長速度過快,未到7天則細胞出現死亡,對觀察cpe不利.
一般情況下,小塑料瓶(8-9ml液體為正常用量),培養長慢單層後,消化細胞,加入6ml培養液,吹勻,吸出其中的2ml,到另外的瓶子,在該瓶中加入14-16ml即可,如果不放心,可以用顯微鏡看一下,細胞數過多則補加培養液,少則補加剩餘4ml的細胞懸液;
維持液,即病毒培養液,配方為:①.mem+2%小牛血清+3%谷氨醯胺+1%雙抗+nahco3;
②. mem+3%谷氨醯胺+1%雙抗+nahco3;兩種維持液的不同在於是否有fbs(小牛血清).我個人曾經做過實驗,在狀態很好的細胞上接種病毒,分別使用兩種不同的維持液,最終結果是一樣的,沒有什麼不同,所以可以根據個人需要進行選擇.
另外,曾經請教過專門做中和實驗的老師,他認為適當的fbs對細胞有保護作用,而且他說這是國外文獻上的報道.
1） 細胞準備
1.1 檢查培養瓶中的單層細胞，以5ml胰酶－edta輕微沖洗
1.2 加入4－5ml 胰酶－edta以覆蓋單層細胞
1.3 放平培養瓶，37℃ 5％co2培養箱中孵育10－20min，直到細胞脫落
1.4 加入5－10ml培養液，洗下細胞後移到離心管中
1.5 以pbs洗細胞兩次（12000rpm, 5min）
1.6 以d-mem重懸細胞，並用血球計數板計數
1.7 以d-mem將將細胞濃度調整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml
1.8 在微量培養板的各孔中加入100μl細胞, 相當於?×10^4細胞/孔
1.9 在37℃ 5％co2培養箱中過夜培養（18－22h），用處於生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定
2） 病毒製備
3） 病毒稀釋
3.1 取凍存的病毒，以病毒生長培養液（vgm）稀釋10倍，即100微公升病毒液+900微公升稀釋液，共1毫公升。（於1.5ml ep管中進行，將混合液充分吹打振盪，很重要！）
3.2 做10倍稀釋
3.3 在另一新1.5ml ep管中加入100μl第一管稀釋病毒液（1/10），按10的比例進行倍比稀釋，再加入900μl稀釋液，將混合液充分吹打振盪。
以此類推共稀釋至10^13倍。
此過程中需要使用加樣器和tip頭。使用前用75%乙醇擦拭加樣器，並用紫外線照射20min，確保無菌。使用新高壓的tip頭，外包裝一定在超淨臺（或安全櫃中開啟）
4）病毒接種：
4.1取細胞培養板，用多道加樣器（又稱排槍）吸去96孔板中的培養液，吸取孵育液或無血清dmem加在每孔中再輕輕吹打一次，然後吸出孵育液（此步目的是去除血清，因為血清能干擾病毒的吸附）。
4.2於各孔中加100ul各不同的病毒稀釋液，每個稀釋度做一列孔，即每個病毒稀釋度做8個平行復孔，根據觀察的習慣，一般從右到左，從上到下，從高稀釋度到低稀釋度到原液加樣。 (病毒稀釋度的選擇10^3—10^12或者10^4—10^13,因為目的基因不同，重組腺病毒滴度差距很大，應該盡量將稀釋度加大，看到有人用的稀釋度是10^6—10^13)
4.3第11列和12列為陰性對照，陰性對照孔中加入100ul含5%胎牛血清的dmem，監測細胞存活情況；切記：設定正常的細胞對照。每次實驗要重複4次，計算標準差。
4.437℃co2培養箱中孵育1h，取出培養板吸去病毒液（從低濃度向高濃度吸取可避免竄孔），加入維持液200l繼續於37℃，5% co2培養5--10天；
4.5逐日觀察，5--10天後倒置顯微鏡下觀察，計算每一列**現cpe（cytopathic effects，cpes）的孔數。只要有一小點或是一些細胞出現cpe即為陽性，如果無法確定，可與陰性對照比較；
4.6如果陰性對照中無任何cpe且細胞生長良好，最低稀釋度100%陽性而最高稀釋度100%陰性，則本試驗即為有效；
4.7計算每一列**現陽性的孔數；
4.8用reed-muench法計算病毒tcid50/ml。
(1)計算各病毒稀釋度陽性孔數目（1）和陰性孔數目（2）
(2)計算陽性和陰性孔的累積數。
陽性孔累積數由下向上累計（3）；陰性孔累積數由上向下累計（4）
(3)計算陽性孔的百分比：比率（5）=（3）/〔（3）+（4）〕，（6）=（5）×100
(4)計算
距離比例（pd）=（大於50%的陽性百分比－50）/（大於50%的陽性百分比－小於50%的陽性百分比）
tcid50的對數=大於50%的陽性百分比的最高稀釋對數 + 距離比例×稀釋係數的對數
（稀釋係數的對數 1:10稀釋為1，半對數稀釋為0.5，倍比稀釋為0.3，1:5稀釋為0.7）
舉例計算：tcid50的測定和計算（reed-muench法）
出現細胞病變（cpe）以及血凝素等的細胞管數分別列於表14-2的第二和第三列,它們的累計數分別列於第四和第五列（根據箭頭所示方向）,第六列為細胞管總數,第七列為出現細胞病變的細胞管數佔細胞管總數的百分率。可見該病毒株的tcid50在10-3（91.6％）和10-4（40％）之間,其確切稀釋倍數可按下列公式計算：
91.6（高於50％的百分數）-50
91.6（高於50％的百分數）-40（低於50％的百分數）
＝41.6/51.6＝0.8
將由上式獲得0.8加在高於50%死亡的稀釋度的對數（3）上,因此該病毒的tcid50應是0.1ml 10-3.
8稀釋的病毒液。查反對數得6310,即該病毒6310倍稀釋液0.1ml等於1個tcid50。
2. 中和實驗
1） 細胞準備
1.1 檢查培養瓶中的單層細胞，以5ml胰酶－edta輕微沖洗
1.2 加入4－5ml 胰酶－edta以覆蓋單層細胞
1.3 放平培養瓶，37℃ 5％co2培養箱中孵育10－20min，直到細胞脫落
1.4 加入5－10ml培養液，洗下細胞後移到離心管中
1.5 以pbs洗細胞兩次（12000rpm, 5min）
1.6 以d-mem重懸細胞，並用血球計數板計數
1.7 以d-mem將將細胞濃度調整到1×10^5/ml --1.5×10^5/ml
1.8 在微量培養板的各孔中加入100μl細胞, 相當於?×10^4細胞/孔
1.9 在37℃ 5％co2培養箱中過夜培養（18－22h），用處於生長相剛達到完全融合的細胞進行病毒的滴定
2）待測血清準備
2.1 動物血清中，含有多種蛋白質成分對抗體中和病毒有輔助作用，如補體、免疫球蛋白和抗補體抗體等。為排除這些不耐熱的非特異性反應因素，用於中和試驗的血清須經加熱滅活處理。
各種不同**的血清，須採用不同溫度處理，豬、牛、猴、貓及小鼠血清為60℃；水牛、狗及地鼠血清為62℃；馬兔血清為65℃；人和豚鼠血清為56℃。加熱時間為20-30min，60℃以上加熱時，為防止蛋白質凝固，應先以生理鹽水作適當稀釋。
2.2 取已滅活處理的血清，在96孔微量細胞培養板上，用稀釋液作一系列倍比稀釋，使其稀釋度分別為原血清的1:2、1:
4、1:8、1:16、1:
32、1:64，或者按1:10，1:
20，1:40，1:80，1:
160，1:320，1:640，1:
1280稀釋，每個稀釋度做3-4個平行孔。
3) 加入病毒,感作
3.1 以vgm將病毒稀釋到100 tcid50/50μl (200 tcid50/100μ)
3.2 除細胞對照孔外每孔中加入與血清量相等的病毒液，在細胞對照孔中加入與血清量相等的vgm
3.3 輕混病毒－血清混和物，37℃ 5％co2培養箱中孵育2h
4）接種細胞
4.1準備用於接種的剛達到完全融合的細胞的培養板，吸掉培養液，加入350μl無血清d-mem培養液以洗掉剩下的fbs
4.2 病毒－血清混和物孵育2h結束後，各取100μl中和液到細胞培養板相應的孔中
4.3 37℃ 5％co2培養箱中孵育2h
4.4 吸掉中和液，加250μl d-mem 洗滌
4.5 加200μl d-mem 在37℃ 5％co2培養箱中孵育3－4d，檢測培養液中血凝活性，以能保護50％細胞培養管不被感染的最高血清稀釋度的倒數作為中和終點。
在製備細胞懸液時，其濃度以在24h內長滿單層為度：血清病毒中和1h後取出，每孔加入100μl細胞懸液。置5%co2 37℃溫箱培養，自培養48h開始逐日觀察記錄，14d終判。
由於各種病毒引起細胞病變時間不同，終判時間應根據病毒致細胞病變的快慢而定。
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