［作者：生物工程二班羅文傑轉貼自：本站原創點選數：2378更新時間：2004-6-29文
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一、專案背景
據who統計，全世界糖尿病患者已接近1.2億，而我國目前糖尿病患者的總數已達到3000萬人，躍居世界第二位，其中數百萬患者長期使用胰島素**。糖尿病例已成為僅次於心腦血管病症和癌症的第三大死亡疾病與頑症。
隨著我國經濟的發展，國人的生活水平的提高，糖尿病的發生率將更高，糖尿病患者的數量也將增加，糖尿病將成為影響我國國民健康水平的重大疾病。國內外對糖尿病越來越重視，各方面研究也在不斷的進行之中，並不斷有相應的研究成果產生。
以知是糖尿病是產生機理是：當人體胰腺b細胞被破壞時，細胞產生胰島素的能力喪失，這樣將導致1型糖尿病的發生；此外，當患者餐時胰島素分泌量不足，因而無法克服餐後血糖的公升高時，2型糖尿病就會發生。因此，不管是1型還是2型糖尿病，都存在有胰島素分泌的不足，只不過1型糖尿病患者胰島素分泌能力完全喪失。
由此可見，1型糖尿病患者或者一部分2型糖尿病患者需要接受胰島素**，以補充自身胰島素的不足或者缺失。
目前國內市場上傳統的降糖藥物**並不能使糖尿病行到根本性**，而胰島素則是通過調節葡萄糖的產生和分解來控制葡萄糖在人體中的供求平衡。其可視為是目前**糖尿病的最佳方式。同樣由於胰島素半衰期短，糖尿病患者隨時需要注射胰島素，一般來說乙個糖尿病患者每天需要注射1克胰島素。
目前醫用的胰島素主要有兩種，一種是從動物臟器中生化提取的動物胰島素，如豬胰島素、牛胰島素等，動物臟器中生化提取產量低、成本高（100公斤動物胰腺只能提取4-5克胰島素，乙個病人所需胰島素要從40頭牛或50頭豬的胰腺中提取）、純度低，療效差；一種是通過基因工程手段的人胰島素，基因重組人胰島素純度高、療效好。目前國內臨床逐漸由國產的豬胰島素（26.9元/400單位）轉向基因工程人胰島素。
作為人體中惟一降低血糖的激素，人胰島素的市場穩定性高，且呈不斷增長態勢。2023年投放市場後的兩年，銷售額分別增長30%和50%；2023年發達國家幾乎都用人胰島素，銷售額為8.84億美元；2023年人胰島素的全求銷售額達到25億美元（預計2023年銷售額不低於19.
5億美元），位於所有藥物的前100名，位於生物工程藥物的前幾名。目前人胰島素主要應用於西方發達國家，如美國和西歐等國。但隨著我國經濟的不斷發展，人民生活水平的不斷提高，人胰島素在我國國內的應用也必將大量增加。
國內外市場對人胰島素的需求將始終處於增長的狀態之中，市場將不斷增大。
二、國內外生產水平
現在有三個國家在生產人胰島素，為丹麥、美國和我國。主要公司有美國eli lilly公司、丹麥nove和我國的通化東寶集團。
2023年1月經我國衛生部批准，美國eli lilly公司的基因重組短效人胰島素進入我國臨床使用，丹麥nove在中國的合資藥廠（分裝）所生產「諾和靈」胰島素也逐漸占領國內市場。目前國內臨床逐漸由國產的豬胰島素（26.9元/400單位）轉向基因工程人胰島素，人胰島素在中國每年有幾個億的潛在市場陳。
2023年10月，中國第一支基因重組人胰島素，由通化東寶與美國泰康合資興建的安泰克（gan tech）生物工程****研製成功，並於2023年1月正式投放市場。
全球最大的胰島素生產企業，世界糖尿病領域的先導--丹麥諾和諾德公司生產的在中國上市的唯一的、劑型齊全的人胰島素系列產品諾和靈人胰島素產品系列為例：
短效中性可溶性人胰島素，採用國際推薦的黃色色標，用英文本母r來表示，又稱它為諾和靈r，具有瓶裝和筆芯兩種劑型。短效諾和靈人胰島素起效快，可在餐前30分鐘內注射，主要用於降低餐後的高血糖；作用維持時間短，因此需要一天內多次注射，一般每天2-3次。
＊中效人胰島素，採用國際推薦的綠色色標，用英文本母n表示，又稱為諾和靈n，具有瓶裝和筆芯兩種劑型。中效諾和靈筆芯人胰島素起效較慢，作用維持時間可以達到24小時，主要作用是維持人體胰島素的基礎分泌，每天單獨注射1-2次或與短效胰島素諾和靈r混合使用。其**為：
諾和靈30r 40iu/ml×10ml 63.6 73.1盒諾和諾德（天津）針劑諾和靈30r預混40iu×10 63.6 73.1支天津市生物化學製藥廠針劑
目前國內的人胰島素市場原料的競爭不是十分激烈，主要在幾個大的醫藥集團之間。而其需求十分旺盛，藥品利潤也較高。
三、生產工藝
本工藝的原理就是研發新的高產人胰島素的大腸桿菌菌種，增加發酵能力，在不改變生產工藝和流程情況下提高人胰島素的產量。
最近日本千葉大學清野進教授領導的科研小組發現了一種與胰島素分泌有密切關係的蛋白質，清野進發現的這種蛋白質存在於分泌胰島素的β細胞裡，起感知器的作用，能夠檢測資訊傳遞物質「環腺苷磷酸」。動物實驗表明，在這種蛋白質不起作用的時候，胰島素的分泌量就大大減少。目前各種人胰島素生產菌中都缺少該蛋白質，則其生產能力也必將受到影響。
本次工藝原理就是測得該蛋白質的表達基因，用人工合成法合成該蛋白質基因，之後選擇大腸桿菌的質粒作為運載體來運載胰島素基因，可以使用puc18質粒載體。選擇限制性內切酶去切割人工合成的人胰島素基因和質粒，使它們有同乙個切點，這樣就可以把人工合成的人胰島素基因接到環狀質粒的運載體上，組成重組體，把新組成的重組體再引入以有人胰島素基因的
大腸桿菌。在puc18載體中，有兩個標記基因，一是apr基因，它專門用於指示dna分子是否進入了宿主細胞，另乙個是lacza基因，它能產生β-半乳糖苷酶α-鏈，當該基因轉入適當的大腸桿菌宿主細胞後，轉化細胞可在加有誘導物：異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（簡稱iptg）和檢測試劑（x-gal試劑）的培養基上形成蘭色菌落。
當把重組dna分子匯入適當的大腸桿菌細胞中時，在加有氨苄青黴素、iptg和x-gal的平板就可觀察到白色菌落。在同一平板上出現的蘭色菌落就是沒有外源dna插入的原載體。將有重組dna分子的大腸桿菌細胞分離培養，選育出可以所需的蛋白質而提高人胰島素的產量的菌種。
在經過幾代的遺傳性狀的觀察後，穩定的高產的菌種即可投入生產中。
待大腸桿菌生長經過幾何增長區後既可進行人胰島素的提取了，可以使用我國目前常用的減壓濃縮法。其主要步驟是：1）提取粗製品：
將大腸桿菌破壁後，加入1．5～2．0倍量的酸性酒精溶液，使ph為2．5～3．0，醇含量為70%左右，在溫度為13～150c攪拌提取3h,壓濾，使浸液盡量濾出。殘渣再用上法提取一次。
合併二次浸出液，放鹼化罐中，在10～150c下加入氨水，使ph達8．2～8，4，拌攪35/min立即壓濾，於澄清的濾液中迅速加入24 mol/l硫酸使ph調至2．5～3．0。在0℃左右放置過夜使酸性雜蛋白沉降，分取清液，真空濃縮（300c以下），使濃縮液量到原體積1/7～1/9，將濃縮液在10min之內迅速加溫至500g立即用冰冷卻至00c，放置3h，將上層脂肪分離（**胰島素），澄清的濃縮液，調ph達2．5，在20～250c下攪拌加入溶液容積25%的精鹽，使全部溶解，置冷處放置3～4h沉澱，用絹布濾集沉澱，再用無水丙酮洗滌數次（除去剩餘的脂肪和水），300c以下真空乾燥得粗製品。
2）精製：
稱取粗製品用ph2．2的7～10倍量的酸水溶解，加30%（按酸水容積）冷丙酮，用5mol/lnh40h調至ph 4.2，再補加所用氨水量的30%冷丙酮。在5℃以下放置過夜，抽濾，沉澱留用**胰島素。
取濾液用5mol/lnh4oh調至ph 6．2～6．4，加入20氯化鋅（znc12），如ph變偏酸再調至ph 6.0，在冰箱中放置過夜，抽濾，濾液口收胰島素。濾餅稱重，每克乾物約用50ml 20%枸椽酸溶解。
加入固體znc12 0．o8g,加丙酮16 m1，攪拌均勻，補加水至100 m1，調ph 6．0～6．2，放冰箱中48 h以上析出結晶，過濾，濾餅收取；濾出母液按上條件，在冰箱中放置2～3d,尚可收口部分結晶。取結晶，用丙酮洗2次，乙醚洗1次，置p205的真空乾燥中乾燥，即得成品，測定生物效價。
所得產品可以自己進一步加工成針劑**，也可以作為原料賣於國內外廠家生產。
四、產品質量要求
本專案的最終產品為人胰島素，若作為其他藥廠的生產原料，可以按其要求的質量要求生產。
若是自己生產成成品，即人胰島素針劑，則其生產的環境和過程應經過gmp認證,既符合我國《藥品生產質量管理規範》中生物製品、無菌藥品的各項要求,如其環境中的潔淨室（區）空氣潔淨度要達到100級等.
最終產品的分裝規格可以參考目前以有的諾和靈的分裝規格,其產品質量應該符合《中國藥典》中精蛋白重組人胰島素注射液的各項指標和檢測要求。相關蛋白質的檢查:取產品每1ml加9.
6mol/l鹽酸溶液3ul酸化後作為供品溶液；取供試品溶液50ul,照人胰島素項下方法檢查,總相關物質不得超過8%。
五、經濟效益
生物工程影響生產能力的關鍵是發酵能力，本專案所得菌種的發酵能力可以較原有菌種提高50%，以通化東寶藥業的人胰島素專案為例:目前已經投入生產的年生產能力達到1000公斤,年平均銷售收入67003萬元,利潤總額16061萬元。而本菌種可以使生產能力至少提高30%,即可以增加年平均銷售收入20000萬元,利潤總額5000萬元左右,其經濟效益十分可觀。
同時可以降低生產成本，進而增強產品的國際競爭力。
六、經費預算
研製高效人工合成胰島素工藝的預算為100萬元，主要用於研發、小試、中試，成品工藝。詳細費用：研發40萬元小試20萬元中試30萬元成品工藝10萬元
七、專案風險
資金主要用於新菌種的研發，菌種研發成功後即可投入生產，可以使用目前已經比較完善的生產工藝和流程進行生產，無需大量改造生產工藝和流程，減少固定投資風險。同時最終產品仍為原產品人胰島素製品，其從新進行臨床試驗以及新藥證書的報批的時間相對於新藥研發時間更短，從而進一步減少投資的時間風險。
八、專案社會效益
該專案一旦成功投產，可以大幅提高我國的人胰島素的生產能力。可以提高我國糖尿病患者的生活質量，減少其因糖尿病而引發各種疾病的危險，同時也可減輕我國糖尿病人的經濟負擔。同時可以增強我國在人胰島素產品在國際市場上的競爭能力，有利於我國擴大在人胰島素國際市場中所佔的份額。
九、參考書目
1、《中國藥品生產質量管理規範》(2023年修訂)2、《中國藥典》2023年版二部3、《微生物學教程》第二版
生物工程012羅文傑
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胰島素劑量設定
胰島素劑量設定的基本方法首先確定血糖控制目標 為每個病人確定個人的血糖控制目標。成年病人的一般控制目標 餐前 80 140mg dl 4.4 7.8mmol l 餐後2小時 180mg dl 10mmol l 入睡前 100 140mg dl 5.6 7.8mmol l 夜間3點 90mg dl 5...
胰島素的運用
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