前言本標準是在參閱了國內外文獻的基礎上，根據我國技術發展水平研究制定的，採用了酶聯免疫法、高效液相色譜－螢光檢測法和氣相色譜-質譜法。本標準由浙江省農業廳提出並歸口。
本標準由浙江省畜產品質量安全檢測中心、浙江省疾病預防控制中心負責起草，浙江一星集團飼料有限責任公司參與起草。
本標準主要起草人：陳慧華、吳平谷、應永飛、任玉琴、屈健、周文海、陳勇、浦琴華。
飼料中萊克多巴胺的測定
1範圍本標準規定了以酶聯免疫（elisa）法、高效液相色譜（hplc）法和氣相色譜－質譜（gc－ms）法檢測飼料中萊克多巴胺的方法，規定gc－ms法為仲裁法。本標準適用於飼料和飼料新增劑中萊克多巴胺的測定。
酶聯免疫（elisa）法為篩選方法，檢測限為0.01mg/kg，高效液相色譜（hplc）法和氣相色譜－質譜（gc－ms）法為定量方法，定量限hplc法為0.1mg/kg、gc－ms法為0.
05mg/kg。線性範圍：酶聯免疫（elisa）法為0.
005ng-0.05ng，高效液相色譜（hplc）法為2.5ng-10ng，氣相色譜－質譜（gc－ms）法為0.
05ng-1.0ng。
2規範性引用檔案
下列檔案中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用檔案，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些檔案的最新版本。凡是不注日期的引用檔案，其最新版本適用於本標準。
gb/t 6682分析實驗室用水規格和試驗方法gb/t 14699.1飼料取樣方法
3試樣製備
按gb/t 14699.1抽取有代表性的飼料樣品，用四分法縮減取約200g，粉碎至過0.45mm孔徑的分析篩，混勻，裝入磨口瓶中備用。第一法酶聯免疫法
4原理與方法4.1原理
本測定方法是酶聯免疫法中的競爭性測定法，其主要原理是：吸附在孔內的萊克多巴胺與標準或樣品中的萊克多巴胺競爭性地與萊克多巴胺抗體相結合，與標準品或樣品相結合的萊克多巴胺抗體被洗滌去除後，只剩下與微孔內藥物相結合的抗體，其再與加入的酶標記的第二抗體相結合，酶底物在酶作用下產生藍色產物，吸光度的高低與樣品中萊克多巴胺的含量成反比。4.
2方法採用萊克多巴胺酶聯免疫試劑盒或類似產品，按試劑盒的使用說明操作。
5試劑和溶液
5.1除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合gb/t 6682二級水的規定。
5.2pbs緩衝液：用水10倍稀釋廠商提供的濃縮pbs緩衝液。5.3工作洗液：用水20倍稀釋廠商提供的濃縮洗液。5.4乙酸乙酯。
5.5碳酸鹽緩衝液：稱取4.3g碳酸鈉（na2co310h2o），2.9g碳酸氫鈉（nahco3），加水至1000ml，搖勻，調節ph值至9.5。
5.6提取液：取10ml甲醇，加90mlpbs緩衝液，搖勻。5.7甲醇。
5.8第二抗體工作液：用第二抗體稀釋液2500倍稀釋第二抗體。
6儀器與裝置
6.1微孔板酶標儀(帶450nm濾光片)。6.2振盪器。6.3冷凍離心機。
6.4微量加樣器及配套吸頭：20μl, 50μl, 100μl, 200μl。
6.5冰箱。6.
6洗板機。6.7生化培養箱。
6.8氮吹儀。
6.9分析天平：感量0.01g。
7測定步驟7.1注意事項
不同品牌的試劑盒其操作步驟可能略有差別，具體操作步驟可根據試劑盒使用說明書略作調整。
7.2試樣處理
取3g試樣於50ml離心管中，加入6ml提取液（5.5），上下手搖數次，加入6ml碳酸鹽緩衝液（5.4），再加入8ml乙酸乙酯（5.
3），振盪30min；以4000rpm的轉速離心5min，移取2.0ml上層有機相至另一新試管中，氮吹至幹。加入50μl甲醇（5.
6）溶解殘餘物後，再加入450μl pbs緩衝液（5.1），即為供試溶液，取50μl進行elisa測定。7.
3測試程式
7.3.1根據所測定樣品及標準數，計算出所需微孔條數，將微孔條插入微孔架，標準和樣品做兩個孔的平行重複，記錄標準和樣品的位置。
7.3.2加入50μl的標準品和處理好的樣品到各自的微孔中，標準和樣品做兩個平行重複。
7.3.3加入100μl第一抗體溶液到每乙個微孔中，在37℃孵育30分鐘後倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.
2）250μl，重複操作兩遍。最後用吸水紙吸乾。
7.3.4加入150μl稀釋的酶標記的第二抗體（5.
7）37℃孵育30分鐘後倒出孔中的液體，將微孔架倒置在洗水紙上拍打（每輪拍打3次）以保證完全除去孔中的液體，再加入工作洗液（5.2）250μl，重複操作兩遍。最後用吸水紙吸乾。
7.3.5加入100μl酶底物液到微孔中，充分混合並在室溫孵育5-10min。
7.3.6加入50μl反應終止液到微孔中，混合後在450nm處測量吸光度值。
8結果計算以空白（濃度為0的標準溶液）吸光度值為100%計算，折算出各標準和樣品的相對吸光度值。
相對吸光度值（%）=標準的吸光度值(或樣品) /空白的吸光度值×100
計算出的標準相對吸光度值繪成為乙個對應濃度(ng/l)的半對數座標系統曲線圖，校正曲線在200-2000ng/l範圍內應當成為線性。相對應每乙個樣品的濃度(ng/l)可以從校正曲線上讀出。
第二法高效液相色譜法
9方法原理
用2％氨/甲醇溶液提取試樣中的萊克多巴胺，經固相萃取柱淨化，濃縮後用2％乙酸溶液定容，用高效液相色譜－螢光檢測法分離測定。
10試劑和溶液
10.1除非另有說明，本法所用試劑均為分析純，水為去離子水，符合gb/t 6682二級水的規定。
10.2乙腈：色譜純。10.3甲醇。10.4乙腈。10.5乙酸乙酯。10.6冰醋酸。10.7無水硫酸鈉。
10.8戊烷磺酸鈉：色譜級。10.9正己烷。10.10氨水。
10.1150％乙腈/乙酸乙酯溶液：取250ml乙腈加乙酸乙酯至500ml，混勻。
10.1250％甲醇/乙酸乙酯溶液：取250ml甲醇加乙酸乙酯至500ml，混勻。
10.132％乙酸溶液：取5ml冰醋酸加水至250ml，混勻。
10.14固相萃取柱）：每根柱填料量為500mg，柱體積5ml。
10.152％氨/甲醇溶液：取20ml氨水加甲醇至1000ml，混勻。
10.16戊烷磺酸鈉溶液：取800ml水，加20ml冰醋酸和0.
87g戊烷磺酸鈉（c5h11o3snah2o），混勻。10.17萊克多巴胺標準溶液
10.17.1萊克多巴胺貯備液（250μg/ml）
精密稱取萊克多巴胺對照品25mg，置100ml容量瓶中，用甲醇（10.2）溶解並定容至刻度，置-20℃冰箱中，可儲存3個月。
10.17.2萊克多巴胺稀釋液(5μg/ml)
精密量取1ml萊克多巴胺貯備液（10.16.1），置50ml棕色容量瓶中，用甲醇（10.2）稀釋並定容至刻度，為萊克多巴胺工作液。10.17.3萊克多巴胺工作溶液
分別準確吸取一定量的標準稀釋液（10.16.2），用2％乙酸溶液（10.12）稀釋、定容，配
製成濃度為0.10μg/ml、0.20μg/ml、0.50μg/ml、1.0μg/ml、2.0μg/ml、5.0μg/ml的標準溶液。
11儀器裝置
11.1高效液相色譜儀（配螢光檢測器）。11.2冷凍離心機能達到5000rpm。11.3振盪器。
11.4離心管50ml，10ml。11.5微孔濾膜0.45μm。11.6渦旋混合器。
11.7分析天平精度0.0001g。11.8旋轉蒸發儀。11.9雞心瓶50ml。11.10氮吹儀。
12測定步驟12.1試樣提取
稱取試樣3.0g，準確加入2％氨/甲醇溶液（10.14）25ml，渦旋振盪1min，超聲振盪10min，5000rpm離心5min，取上清液10 ml至雞心瓶中，50℃旋轉蒸乾。
12.2試樣淨化
用2ml甲醇（10.2）和2ml正己烷（10.8）溶解雞心瓶中的殘餘物，重複一次，棄去上層；再加入2ml正己烷（10.
8），重複一次，分出甲醇至10ml離心管中，45℃下氮氣吹乾。用5ml乙酸乙酯（10.4）溶解，加少量無水硫酸鈉（10.
6），5000rpm離心3min。洗滌液過固相萃取柱（10.13），先經5ml乙酸乙酯潤洗）用3ml50％乙腈/乙酸乙酯溶液（10.
10）洗滌柱子，然後用5ml50％甲醇/乙酸乙酯溶液（10.11）洗脫收集，氮吹至幹。12.
3定容用2％乙酸溶液（10.12）定容到1ml，過膜，上機。12.4測定
12.4.1高效液相色譜條件
色譜柱：c18柱，長250mm，內徑4.6mm，粒度5μm，或相當者。保護柱：c18柱，長20mm，內徑3.9mm，粒徑5μm，或相當者。
流動相：戊烷磺酸鈉溶液（10.15）：
乙腈（10.1）＝80：20，使用前脫氣。
流速：1.0ml/min。
激發波長：226nm。發射波長：
306nm。進樣量：50μl。
12.4.2上機測定
萊克多巴胺對照溶液和試液分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積進行計算。13結果計算
試樣中萊克多巴胺的含量按下式計算：
x＝n×ai×cs×vs/as×m式中：
n——樣品稀釋倍數；ai——樣品峰面積；as——對照溶液峰面積；vs——定容體積（ml）；
cs——對照溶液濃度（μg/ ml）；m——樣品重量（g）；
x——試樣中萊克多巴胺的含量（mg/kg）；
測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數字。
14精密度
14.1重複性
實驗室內平行測定間的相對偏差不大於10％。14.2再現性
實驗室間測定的相對偏差不大於15％。
第三法氣相色譜-質譜法
15方法原理
試樣中萊克多巴胺先用2％氨/甲醇溶液提取，甲醇和正己烷分配脫脂，然後用柱淨化，bstfa（雙三甲基矽基三氟乙醯胺）+tmcs（三甲基氯矽烷）衍生，最後用gc－ms法進行定性定量分析。
16儀器與試劑
16.1氣-質聯用儀。16.2烘箱。
16.3bstfa（雙三甲基矽基三氟乙醯胺）+1%tmcs（三甲基氯矽烷）。
16.4萊克多巴胺標準貯備溶液（5mg/ml）：準確稱取50mg萊克多巴胺於10 ml容量瓶中，用甲醇溶解並定容至刻度，存放在冰箱中備用。
16.5萊克多巴胺標準工作溶液：取萊克多巴胺標準貯備溶液，用甲醇稀釋至所需濃度。16.6甲苯。
16.7其它儀器，同11。16.8其它試劑，同10。
17測定步驟17.1試樣提取同hplc法12.1。17.2試樣淨化同hplc法12.2。17.3試樣衍生
蒸發剩餘物加0.1 ml bstfa+1%tmcs（16.3），加蓋後於旋渦混合器上**，在80℃的烘箱中加熱1.
0 h，氮氣吹乾，加0.2ml甲苯（16.5）溶解。
取適量的萊克多巴胺標準工作溶液（16.4），氮氣吹乾，與試樣同法進行衍生化。17.4色譜條件
色譜柱：5%苯基甲基聚矽氧烷彈性石英毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm)，或相當者。
進樣口溫度：300℃。
柱溫程式：初溫150℃，保持3 min，然後以10℃／min公升至230℃，保持10min，再以20℃／min公升至280℃保持10min。載氣：
高純氦氣（99.999%）。流速：
1.0ml/min，不分流進樣。進樣量：
1.0l。17.
5質譜條件ei源：源溫230℃。電子能量：
70ev。介面溫度：280℃。
電子倍增器電壓：1506v。質量掃瞄範圍：30～550u。選擇離子監測方式（sim）。
監測離子（m/z）：267、250、502，定量離子250。溶劑延遲：5 min。17.6上機測定
萊克多巴胺對照溶液和試液分別注入氣相色譜－質譜聯用儀，記錄譜圖，按外標法以峰面積進行計算。
18結果計算結果按下式計算：x=m1×n/(m×1000)式中：
x——樣品中萊克多巴胺含量（mg/kg）；m1——質譜測定對應的萊克多巴胺量（ng）；m——取樣量（g）；n——稀釋倍數；
測定結果用平行測定的算術平均值表示，保留3位有效數字。
19精密度
19.1重複性
實驗室內平行測定間的相對偏差不大於10％。19.2再現性
實驗室間測定的相對偏差不大於15％。
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