反卷積是一種計算密集型影象處理技術，通過該技術，可以提高顯微影象的對比度和清晰度。物鏡數值孔徑受限的情況下，這項技術主要是依靠一系列去模糊處理技術來提高影象的質量。
基本上所有通過數碼螢光顯微鏡拍攝的影象都可以反卷積處理。還有一些新的技術將反卷積應用在透射光影象中。在所有反卷積技術的研究應用中，3d成像是最常用到反卷積處理的。
圖1標註了反卷積處理中需要用到的光學元件。樣品是乙個理想的細胞，由普通光學顯微鏡延z軸獲得一系列光切圖（右圖）重建形成。在每乙個焦平面上，相對應的平面影象被探測器記錄並儲存在計算機中。
在反卷積分析中，每乙個焦平面上的影象被處理重建為乙個3d影象。
反卷積技術常被認為是共聚焦顯微鏡的很好的替代品。嚴格來說這種說法並不準確，因為利用針孔光闌獲得的共聚焦影象也可以用反卷積技術分析。然而，文獻中記載的大部分涉及反卷積技術的實驗，都是應用於寬場螢光顯微鏡上的。
當今反卷積演算法處理的影象可以跟共聚焦拍攝的影象相媲美。事實上，共聚焦顯微鏡與寬場反卷積處理顯微技術都可以去模糊，但工作原理是相反的。
共聚焦顯微鏡是通過安裝在物鏡和檢測器之間的針孔光闌，來阻止非焦平面上的模糊影象，而只有焦平面上的光可以通過。相反，寬視場顯微鏡允許探測器接收到的所有光通過，隨後利用反卷積技術對獲得的影象去模糊處理。共聚焦顯微鏡尤其適合觀察厚的樣品，比如胚胎或者組織；而寬視場反卷積顯微鏡很適合拍攝在非常低光水平的樣品，比如螢光標記的活細胞和核酸。
影象降質的原因
影象降質可分為4個獨立的原因：雜訊，散射，眩光和模糊。圖2分別展示了上述4種原因造成的影象效果。
反卷積技術的主要任務就是去除非焦平面上的模糊。反卷積演算法確實可以去除雜訊，但只是整體上相對簡單的去除。
1. 雜訊。雜訊通常被描述為影象細節的擬隨機紊亂（quasi-random disarrangement），最嚴重的形式就是白雜訊（white noise）或者黑白相間雜訊（salt-and-pepper noise），就是類似於電視中影象訊號不好導致螢幕上的雪花點（圖 2(a)）。
這種型別的雜訊被定義為擬隨機，是因為如果雜訊的**是已知的，那這種雜訊的分布是可以**的。在數碼顯微鏡中，雜訊的主要**是訊號自身（光子雜訊）或者成像系統。雜訊產生的兩種原因已經了解，因此對雜訊的分布統計也是可知的。
訊號產生的雜訊呈泊松分布（poisson distribution），而成像系統產生的雜訊常常呈高斯分布（gaussian distribution）。因為雜訊產生的這兩種原因已經了解的非常清楚，因此通過使用合適的影象過濾器可以很容易的去除，這在很多反卷積處理的軟體中都可以做到，是乙個可選的影象預處理過程。
2. 散射。散射常指的是由於樣品的異質折射率而引起的光的隨機干擾。
散射會引起影象細節真正的隨機紊亂，如圖2（b）。雖然樣品中的散射並沒有乙個滿意的**方法，但是研究表明，散射的程度與樣品的厚度和樣品周圍包埋材料的光學特性密切相關。散射隨著樣品的厚度和樣品內部結構的散射率異樣性而增加。
3. 眩光。與散射類似，眩光也是由光的隨機擾動引起的，但常常由光學元件（如鏡頭、濾光片等）引起而不是樣品本身。
當今的顯微鏡，通過對鏡頭和濾光片的抗反射塗層，鏡頭細化成像技術，光學用膠合劑和玻璃成分等的改進，眩光的程度已經降到最低。圖2(c)就是乙個典型的眩光影象。
4. 模糊。模糊是光通過成像系統的光學鏡片元件時的非隨機擴散引起的（圖2(d)）。
模糊產生的主要原因是光的衍射，僅僅由於模糊引起的影象解析度受限，被稱為衍射限制（diffraction-limited）。它代表了任何乙個成像系統固有的侷限，而且是評價乙個光學系統的畫素有限性的決定性因素。光學原理中闡述的非常複雜的模糊模型，在高速計算機的幫助下可以應用在光學顯微鏡的成像上。
這就是反卷積的基本依據。因為模糊在反卷積中的基礎重要性，它的理論模型在本文的其他段落有詳細討論。然而，需要強調的是，所有的成像系統產生模糊，跟樣品或者機械電子元件引起的影象降質形式完全無關。
這種光學模糊跟其他型別的影象降質無關，使得反卷積去模糊成為可能。
光和物體的相互作用主要源於物理現象，如散射、眩光和模糊。但是，乙個特定材料中的分子的組成和排列（無論是玻璃，水或者蛋白）都有特定的光學特性。反卷積的目的，就是區分散射、眩光和模糊發生的位置及產生這些現象的數學模型的可能性。
因為散射在樣品中發生位置不固定，所以被認為很難建模。相反，因為模糊是顯微鏡光學系統的作用，所以很容易建模。這樣的模型使得去模糊成為可能，反卷積可以使用這個模型去模糊。
點擴散因子（psf）
模糊的模型上公升到理論光學上是以3d點擴散因子的概念為基礎的。這個概念是反卷積的重要基礎，為了避免影象偽影，更需要深入了解這個概念。點擴散因子是建立在樣品空間的小點光源的無限擴散基礎上。
因為顯微成像系統在這一點上僅僅收集到部分發射光，而這種光不能完美的集中在3d影象的點上。取而代之的是，這一點顯示較寬而呈三維擴散方式。因此，點擴散因子是用來形容乙個理想點光源的3d衍射型別。
以已有的成像模式為基礎（寬視場，共聚焦，透射光），點擴散因子有不同的形狀和結構。在寬視場螢光顯微鏡中，點擴散因子的形狀類似於被一團寬的光環包圍的橢圓形足球。為了在三維空間上描述點擴散因子，通常使用3軸座標系統，其中x和y軸是樣品焦平面的座標軸，而z軸與顯微鏡光軸平行。
在這種情況下，點擴散因子表現為一系列x-y軸同心的環，見圖3。在寬視場的點擴散因子中心的x-y軸縱切影象中顯示為一系列x-y軸同心的環，在經典的光學顯微鏡文獻中被稱為艾里斑（airy disk）。
兩個x-z投影的點擴散因子顯示出不同的球面像差（圖3）。光軸與影象垂直的軸平行。左圖中的點擴散因子展示了最小的球差，而右圖中的點擴散因子球差非常大。
需要注意的是，右圖中，軸不對稱和沿光軸中間的節點增寬，會引起軸向解析度的降低和訊號的模糊。理論上說，點擴散因子的大小是無限的，遠離焦平面的總光強度與焦平面的光強度是相同的。但是，光的強度降低很快，最終會變得跟雜訊分不開。
使用高數值孔徑的油浸物鏡（1.40），無像差的點擴散因子，在焦平面占用0.2 μm2，擴散超過90次，在焦平面上下擴散到1mm範圍內。
記錄這些點擴散因子**所用的樣品是懸浮在甘油中（折射率=1.47）0.1mm直徑的螢光點，鏡油的折射率在圖中標示出來了。
點擴散因子如何影響成像是乙個重要的考慮因素。影象形成的理論模型將點擴散因子作為影象的基本單元。換句話說，點擴散因子對於影象來說相當於磚頭對於房子的作用。
最好的影象就是點擴散因子的集合，增加放大倍數不會改變這個事實。在《光學原理》一書（born and wolf: principles of optics）中有闡述「通過增加目鏡的倍數，並不會增加原始圖中沒有的細節，因為原始影象的每乙個部分都是乙個小的衍射圖，而從目鏡看到的實際影象是放大影象的集合」。
舉例來說，要考慮在蓋玻片和載玻片之間微小的螢光點的數量。焦平面上的樣品影象呈星點雲狀，當用高解析度觀察時，每乙個點實際上就是一系列小的同心環（圖4(a)）。如果稍微偏離焦平面，很多更大的同心環就會在剛才的成像位置顯示（圖4(b)）。
在收集3d影象的時候，每乙個螢光點的完整的點擴散因子被記錄。點擴散因子描述了通過成像系統中光的每乙個點的情況。
模糊過程就是卷積的數學模仿。卷積運算時描述樣品中每乙個點的點擴散因子。來自每乙個點的發射光是對點擴散因子的卷積運算，產生最後的影象。
不幸的是這個卷積出來會使樣品影象變成模糊區域。影象中每乙個點的亮度與樣品中每乙個螢光點的卷積運算線性相關。因為點擴散因子是三維的，點擴散因子的模糊在三維影象中固有的。
任何乙個焦平面的影象包含了該平面的點模糊和其他平面的點。
總的來說，影象的形成是由樣品的點擴散因子的卷積計算獲得的。反卷積與這個過程相反，試圖從模糊影象中重建清晰影象。
點擴散因子中的像差
點擴散因子被定義為理論上利用衍射的數學模型，或者經驗上獲取螢光點的三維影象（見圖3）。乙個理論上的點擴散因子通常有軸向對稱和徑向對稱。實際上，點擴散因子是在x-y軸上面或者下面的對稱（軸向對稱）和z軸對稱（徑向對稱）。
乙個經驗上的點擴散因子可以有完美的對稱衍生出（見圖3）。這種衍生，通常指的是像差（aberration），由成像系統光學套件中任何乙個部分的不規則或不對稱引起，尤其是物鏡，但是其他部分也能引起像差，比如，反射鏡、分光器、濾光片、光闌、孔徑等。
光學元件的質量越好，經驗點擴散因子越能接近理想的對稱狀態。共聚焦和反卷積顯微鏡技術中的點擴散因子都與理想值非常接近。
很多有經驗的專業顯微鏡使用者都了解，光學顯微鏡中最常見的像差是球面像差。球差表現為點擴散因子形狀的軸向對稱，尤其延z軸，同時大小增加，（圖3）。結果是解析度和訊號強度嚴重降低。
實際上，球差最常見的**是由物鏡前鏡頭浸入的基質的折射率和樣品浸入的基質決定。如何減少無處不在的像差至關重要。雖然反卷積技術可以部分恢復失去的解析度，但是，即使再多的影象處理過程也不能恢復丟失的訊號。
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