實驗五病原性球菌
目的(一) 掌握致病性葡萄球菌的特徵；抗鏈球菌溶血素「o」試驗；甲型鏈球菌與肺炎鏈球菌區別。
(二) 熟悉三種鏈球菌在血平板上的區分；肺炎鏈球菌、腦膜炎奈瑟菌的形態特徵。
(三) 了解病原性球菌的形態、染色性。
內容(一) 病原性球菌的形態及染色性(示教)。
(二) 葡萄球菌培養及生化特性(示教)。
(三) 致病性葡萄球菌的鑑定(操作)。
(四) 鏈球菌的培養與抗鏈球菌溶血素「o」試驗(示教與操作)。
(五) 肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的區別(示教)。
(六) 膿汁或咽拭子分離培養(操作)。
一、病原性球菌的形態及染色性(示教)
1．葡萄球菌的形態及染色性(示教)
【材料】
金黃色葡萄球菌革蘭染色示教片。
【方法】
油鏡觀察細菌的形態、排列及染色性。
2．鏈球菌的形態及染色性(示教)
【材料】
乙型鏈球菌血清肉湯培養物製作的革蘭染色示教片。
【方法】
油鏡觀察鏈球菌的形態、大小、排列及染色性。
3．肺炎鏈球菌的形態結構及染色性(示教)
【材料】
肺炎鏈球菌革蘭染色示教片、肺炎鏈球菌莢膜示教片。
【方法】
油鏡觀察二張示教片中肺炎鏈球菌的形態結構特點及其染色性。
4．腦膜炎奈瑟菌的形態及染色性(示教)
【材料】
腦膜炎奈瑟菌革蘭染色示教片。
【方法】
油鏡觀察注意形態、大小、排列以及染色性。
5．淋病奈瑟菌的形態及染色性．
【材料】
淋病性尿道、**膿汁塗片（革蘭染色）。
【方法】
油鏡觀察細菌形態、排列、在細胞內或外及染色性。
二、葡萄球菌培養及生化特性(示教)
【材料】
1．金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌血瓊脂平板培養物
2．金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌甘露醇管
【方法】
1．取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的血瓊脂平板培養物，觀察二種葡萄球菌單個菌落的形態、大小、表面、邊緣、透明度、顏色及溶血性(如顏色不易區別時，可用濾紙片揩抹菌落觀察)。
2．取金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的甘露醇發酵管，觀察二者對甘露醇的分解情況。
三、致病性葡萄球菌的鑑定
致病性葡萄球菌的鑑定，一般實驗室都根據以下特徵，其中尤以血漿凝固酶試驗意義最大。
1．產生金黃色色素。
2．對家兔或羊紅細胞有溶血作用。
3．分解甘露醇，產酸不產氣。
4．血漿凝固酶試驗陽性。
5．耐熱dna酶試驗陽性。
血漿疑固酶試驗：試管法(示教)
【材料】
見實驗四。
【方法】
見實驗四
耐熱dna酶試驗(示教)
【原理】
致病性葡萄球菌能產生dna酶，它可特異地分解dna的磷酸戊糖聯結的磷酸二酯鍵；且有明顯耐熱性，經180℃15分鐘或60℃2小時也不滅活。此酶最適ph9.0，在含dna基質的瓊脂一tris緩衝液中(ph9.
0)，隨dna被分解指示劑甲苯胺藍從藍色變粉紅色。
【材料】
經100℃煮沸15分鐘後的金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌24小時液體培養物；甲苯胺藍-dna-瓊脂(ph9.0)。
【方法】
1．取裝有3ml甲苯胺藍-dna-瓊脂培養基的小試管置沸水浴中溶化，澆小玻片一塊(瓊脂全部用完)，待瓊脂冷卻凝固後，以3mm直徑打孔器打2個孔。
2．用無菌滴管吸取加熱冷卻後的金黃色葡萄球菌或表皮葡萄球菌菌液，加人不同的小孔中，置37℃培養2~3小時後觀察結果。
3．凡小孔周圍出現透明粉紅色小圈者為陽性，小孔周圍仍為藍色不透明者為陰性。
注：指示劑甲苯胺藍在酸性中呈紅色，在中性或弱鹼性溶液中呈藍色。
四、鏈球菌的培養與抗鏈球菌溶血素「o」試驗
(一)培養特性(示教)
【材料】
甲、乙、丙三型鏈球菌血瓊脂平板及乙型鏈球菌10％兔血清肉湯培養物。
【方法】
1．觀察三種鏈球菌在血瓊脂平板上的菌落形態，注意其大小、表面、透明度及溶血情況。
2．觀察鏈球菌在10％兔血清肉湯中生長情況(混濁、沉澱、表面生長)。
(二)抗鏈球菌溶血素「o」(aso)試驗(操作)
【原理】
鏈球菌侵人體內可釋放溶血素「o」(so)，它刺激機體產生相應抗體(aso)。試驗時先以溶血素「o」與病人血清混勻產生中和反應，再加入so乳膠試劑，若病人血清中aso量很多，未被中和掉的抗體則與乳膠試劑反應，產生清晰凝集，是為陽性；反之為陰性，故本試驗屬體外中和反應，觀察到的現象為間接凝集。
【材料】
8單位/毫公升鏈球菌溶血素「o」，l:15病人血清，鏈球菌溶血素「o」乳膠試劑，黑底玻片，滴管，對照（正常）血清。
【方法】
1．取已稀釋的病人血清與正常血清各一滴，分別滴於玻片的兩側，然後於兩側各加一滴8單位/毫公升鏈球菌溶血素「o」，晃搖或用牙籤混勻2分鐘，使其充分混勻。
2．於上述混合液中各加一滴乳膠試劑，晃搖或用牙籤混勻3分鐘，使其充分混勻。
3．立即觀察結果：
(1)有清晰凝集者為陽性，血清滴度》500單位/毫公升。
(2)無凝集者為陰性。
「注」：若需進一步測定其血清滴度，用生理鹽水將陽性血清再作對倍稀釋，再按第2項進行實驗，若仍呈清晰凝集時，則血清滴度》800單位/毫公升。
五、肺炎鏈球菌與甲型鏈球菌的區別(示教)
(一)培養特性(示教)
【材料】
肺炎鏈球菌及甲型鏈球菌血瓊脂平板培養物
【方法】
觀察並比較兩種細菌菌落的大小、形態及溶血性等。
(二)菊糖發酵試驗(示教)
【材料】
肺炎鏈球菌及甲型鏈球菌菌落，菊糖發酵管。
【方法】
1．挑取肺炎鏈球菌及甲型鏈球菌菌落分別接種於菊糖發酵管中，37℃培養10~24小時。
2．觀察兩種細菌在葡糖管中生長後的情況，以溴甲酚紫變色與否作為是否發酵菊糖的判斷依據。
(三)膽汁溶菌試驗(示教)
【材料】
肺炎鏈球菌及甲型鏈球菌血清肉湯培養液18小時生長物，去氧膽酸鈉溶液，乾燥小試管，1毫公升無菌吸管、試管架、生理鹽水、37℃水浴。
【方法】
1．取潔淨小試管4支，標明1、2、3、4。於第一及第二管內各加入0.2毫公升牛膽汁或10%膽鹽溶液，第三及第四管中各置0.2毫公升生理鹽水。
2．用一吸管取0.8亳公升肺炎鏈球菌血清肉湯培養液置於第一管，再吸取0.8毫公升至第三管。
用另一吸管吸取0.8毫公升甲型鏈球菌血清肉湯培養物於第二管；又0.8毫公升於第四管，混勻後置37℃水浴箱中15分鐘到一小時，取出觀察，若液體變清即為膽汁溶菌陽性，否則為陰性。
六、膿汁或喉拭子分離培養(操作)
【材料】
1．標本：膿汁或喉拭子。
2．培養基：血瓊脂平扳、甘露醇發酵管、菊糖發酵管。
3．兔血漿、生理鹽水、毛細滴管、吸管、小試管、試管架、革蘭染液、玻片。
【方法】
1．將膿汁或喉拭子作塗片(注意先分離培養，後作塗片，避免汙染)，革蘭染色後鏡檢，觀察細菌形態、排列及染色性。
2．將膿汁或喉拭子材料接種血瓊脂平板，置37℃培養18~24小時。
3．根據菌落特點及塗片檢查結果，作出初步判斷，必要時再作進一步鑑定。
（1）若菌落中等大小、完全溶血、不透明、產生金黃色色素、塗片革蘭染色陽性，葡萄狀排列，可能是金黃色葡萄球菌，可進一步做血漿凝固酶試驗和甘露醇發酵試驗，確定其致病力。
（2）若菌落較小、半透明、完全溶血、塗片革蘭染色陽性 、大都呈鏈狀排列，為乙型鏈球菌。
（3）若菌落較小、半透明、綠色不完全溶血環，塗片革蘭染色陽性 、呈短鏈狀排列，為甲型鏈球菌或肺炎鏈球菌，需要進一步鑑別，可作膽汁溶菌和菊糖發酵試驗。
學生通過判別做進一步的實驗（甘露醇發酵和菊糖發酵試驗）。將接種後的甘露醇發酵管和菊糖發酵管放入37℃孵箱。
附錄：血瓊脂平板培養基：加熱融化ph7.
6的肉湯瓊脂培養基100毫公升，冷至45℃~50℃時，以無菌操作加入脫纖維的兔血或羊血5~10毫公升。搖勻後傾注平板，冷凝後即成。37℃孵譽24小時，無菌生長，即可使用。
血瓊脂平板是營養培養基，因血液內含多種營養物質，可促進營養要求較高的細菌的生長。血瓊脂平板也可用來檢測細菌的溶血性。血液不耐熱，故需待瓊脂稍冷後才能加入。
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