一、什麼是es細胞顯微注射？
答：胚胎幹細胞顯微注射是製作基因敲除小鼠的乙個最常用的方法。主要過程是將攜帶目的基因的胚胎幹細胞注射到小鼠的囊胚腔中獲得嵌合體小鼠。
所得嵌合體小鼠的組織，將同時含有**於囊胚的細胞和胚胎幹細胞。嵌合體小鼠必須和野生型小鼠配種以決定遺傳改變的生殖系能否傳遞，這樣可能獲得轉基因或打靶基因（**於胚胎幹細胞）穩定的生殖系傳遞的小鼠。一般情況下，大約能獲得50%繼承了目的基因的後代。
二、嵌合體
遺傳學上用以指不同遺傳性狀嵌合或混雜表現的個體。免疫學上的涵義則指乙個機體身上有兩種或兩種以上染色體組成不同的細胞系同時存在,彼此能夠耐受,不產生排斥反應,相互間處在嵌合狀態。在基因敲除鼠中指通過向囊胚注射被外源基因轉化了的胚胎幹細胞，使得發育成為的個體中含有不同基因型的細胞，產生的個體也叫嵌合體，即該生物體中嵌合了兩種不同遺傳結構的細胞（一種是基因型被改變了的細胞，另一種是原來的基因型的細胞）。
三、條件性敲除的原理？
答：cre-loxp系統是源於p1噬菌體的乙個dna重組體系,由cre酶和相應的loxp位點組成,它能導致重組發生在特定的dna序列處(loxp位點),該系統可以將外源基因定點整合到染色體上或將特定dn**段刪除。基於cre-loxp的基因打靶要分兩步來進行。
首先要在胚胎幹細胞的基因組中引入loxp序列，這一步可以通過打靶載體的設計和對同源重組子的篩選來實現。下一步通過cre介導的重組來實現靶基因的遺傳修飾或改變。cre-loxp系統既可以在細胞水平上用cre重組酶表達質粒轉染中靶細胞，通過識別loxp位點將抗性標記基因切除，又可以在個體水平上將重組雜合子小鼠與cre轉基因小鼠雜交，篩選子代小鼠就可得到刪除外源標記基因的條件性敲除小鼠。
四、如何鑑定和挑選嵌合體？
答：動物只有部分組織細胞整合有外源基因，則稱為嵌合體動物。它的鑑定主要根據毛色去鑑定。
注射的es和囊胚**不同的小鼠品系。它們的毛色不同。因此可以根據毛色的嵌合率來鑑定和挑選嵌合體。
五、rosa26與定點插入？
答：利用同源重組技術，把外面的cdn**段或者其他dn**段，定點插入到rosa26位置。rosa26是乙個安全區域，外源性的基因定點插入這個位點不會影響其他基因的表達。
常見問題
1、你們是否接受打靶載體或者重組的胚胎幹細胞之後的服務工作？
目前公司主要提供基因敲除定製化的全程服務，同時也可以承擔打靶載體構建、細胞轉染和顯微注射等服務專案。
2、您公司的c57bl/6 野生型胚胎幹細胞株是否可以**？
c57bl/6 野生型胚胎幹細胞株我們是不對外**的。這個細胞株是我們自主研發並具有自主智財權的細胞系。鑑於基因敲除工作的重要環節以及是否可以得到乙個比較好的germline transmission的關鍵就是是否有乙個高質量的es cell line，因此這個es cell line已經成為我們公司的最核心的資產。
所以，非常抱歉！我們不能對外**，請您諒解！
3、公司最後提供給客戶多少只f1代小鼠？有相關的檢測方法或檢測報告嗎？
我們最後提供給客戶的是不少於兩隻的f1雜合子小鼠。一般情況下，我們可以提供更多的f1代雜合子小鼠。我們會有相關的檢測方法和最終的檢測報告提供給您，您也可以自己進行核實檢測！
也可以在我們的幫助之下完成。
4、客戶委託公司製備基因敲除小鼠需要提供哪些材料？
客戶只需要告訴我們要操作的基因名字和您的特殊要求。對於沒有經驗的客戶，我們會免費為您提供諮詢，了解您的需求，以及想得到的結果，為您提供最佳的設計方案。我們會對該基因進行序列分析後，給您乙個初步的設計，雙方溝通沒有問題後，我們會簽署乙份技術服務合同，然後我們進行bac的訂購，開始模型的製備。
直到您得到f1代小鼠。
5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服務？
我們公司現在主要是提供各種基因敲除小鼠模型的製備服務。有關基因敲除的大鼠模型，我們公司正在對技術進行研發和優化。所以現在還不能為您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！
請****公司的**。我們一旦開始提供大鼠基因敲除服務，我們將在公司**上公布（估計在2023年）。
6、公司提供基因敲進服務時，對敲進的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？
公司提供基因敲進服務時，對於特殊的基因，需要客戶提供cdna資訊，插入基因片段的大小一般在5k以下，效果比較好。對於5-10kb的，效率可能會低一些。對於大片段的敲進，由於重組效率將大大地降低，我們可能會收取較多的費用。
7、公司會安排多少個陽性轉殖進行囊胚注射？
我們通常在注射的時候會安排四個轉殖，但是我們做陽性重組胚胎幹細胞篩選的時候通常要求得到不少於6-8個轉殖，以備篩選更好的注射轉殖之用。而且，我們的最終目標是要得到優良的germ-line transmission。
8、公司如何對轉染的esc進行篩選，如何確保目的基因的正確插入?
我們在構建打靶載體時會引入neo抗性基因篩選標記，同時在打靶載體特定位置引入酶切位點。打靶載體電轉細胞後，首先進行g418的抗性初篩。之後，我們會通過兩次southern雜交實驗，對插入位點的兩端進行驗證，以此確保目的基因完整的插入到正確位置，以及其它位置沒有隨機插入。
9、公司製備完成的小鼠如何運輸？
公司在根據客戶的要求得到f1雜合子小鼠後，我們會根據客戶的具體要求選擇運輸方式與運輸日期。如果您沒有特殊要求，我們會通過專業的實驗動物運輸公司，以空運的方式安排運輸。
10、何謂flox小鼠？
所謂flox小鼠是指在某個基因的某個外顯子兩側各放乙個loxp序列。這段序列就是flanked by loxp，也就叫做flox小鼠。這種flox小鼠一般要通過設計構建打靶載體、胚胎幹細胞重組、囊胚顯微注射、和嵌合體小鼠傳代來獲得。
11、條件性敲除設計中，為什麼在抗性基因的兩側設計的是frt-flip重組系統，而敲除目的基因用的是cre-loxp重組系統？
在設計中，其中的乙個系統是為了把抗性基因去掉。另乙個系統是為了把目的基因去掉。frt-flip系統或cre-loxp系統都可以用來放在抗性基因或是目的基因外顯子的兩側。
理論上是沒有區別的。只所以「在抗性基因的兩側設計的是frt-flip重組系統，而敲除目的基因用的是cre-loxp重組系統」，主要有以下幾個原因：
1）工具鼠：cre-loxp系統已經用了將近20年了，科學家研發了很多的cre工具鼠。其實目前絕大部分工具鼠都是cre工具鼠。
現在大家做乙個flox(flanked by loxp)小鼠花費很多的時間和金錢，都會希望自己的小鼠與更多的工具鼠交配，得到更多的結果。
2) flip酶的活性比較低。flip酶是從酵母中分離出來的。其最適溫度是30度，而小鼠的體溫是37度。
儘管現在有些實驗室對flip的37度適應性做了優化，但應該還是沒有cre的活性好。把frt放在抗性基因的兩側，得到小鼠之後，跟flip deleter小鼠交配，篩選出去掉了抗性基因的小鼠，就是flox小鼠了。即使flip的活性不高，也可以得到flox小鼠。
這些flox小鼠可以跟各種cre工具鼠交配，得到條件性敲除小鼠。反過來，如果用cre來去掉抗性基因，得到的是frt小鼠。這種情況下，一是可用的工具鼠很少，二是即使有，效率也可能不高。
如果看5、6年前的文章，大家其實是把loxp不僅放在要敲除基因的兩側，也用來敲除抗性基因(neor)。那個時候篩選起來特別麻煩。因為要做大量的篩選，篩出只敲掉抗性基因，而沒有敲掉目的基因的flox小鼠。
需要很多的時間和精力。
12、怎樣用最簡單的描述區分基因敲除、基因敲進、基因敲降、和轉基因
1）基因敲除（knockout)：把乙個基因從基因組裡面全部或部分拿掉；
2）條件性基因敲除（conditional ko): 把乙個基因從特定細胞的基因組裡面全部或部分拿掉；
3）基因敲進（knockin)：在基因組裡放乙個外源基因（如gfp, lacz, tdtomato等）；
4）基因敲降（knock-down): 通過降解mrna的方法降低蛋白的表達水平（一般是用microrna或sirna)。
5）轉基因：在體內過表達乙個特定基因，就象在細胞系裡用高水平表達載體表達乙個蛋白。
13、嵌合鼠的嵌合率很高，但是得不到雜合子是什麼原因？
高嵌合率不代表種系傳遞就好。許多實驗室，包括我們公司，都發現特別高嵌合率的嵌合體小鼠不能交配產仔。原因不是很清楚,這應該跟打靶的基因是不是性染色體沒有關係。
可以檢查一下嵌合體小鼠是不是有隱睪的現象。另外，毛色看到的嵌合率與生殖細胞的嵌合率不一定完全一致。也有人認為雄性es細胞注射到雌性囊胚使得胚胎發育過程中性別轉化不完全，造成的所謂不男不女現象。
現在好像還沒有乙個定論知道到底是什麼原因。
14、rosa26位點插入外源基因的設計原理是什麼？
rosa26位點基因敲入,在原來的設計中，目的基因cdna上游帶有一段轉錄終止序列「stop」（3個拷貝的sv40多聚a序列，tpa）,轉錄終止序列的兩端各有乙個loxp位點，將此結構定點嵌入rosa26基因位置，整個結構的轉錄受rosa26啟動子控制。在沒有cre的情況下，由於rosa26啟動子與目的基因之間「stop」的存在，目的基因不能被表達。如果有cre表達， cre重組酶將去除「stop」，rosa26啟動子就可以啟動目的基因表達。
但是，由於rosa26啟動子是乙個弱啟動子，其啟動能力有限，目的基因經常達不到研究人員需要的表達水平。為了解決這一問題，可以對原rosa26基因敲入系統做改進，引入了乙個強效的啟動子，如cag啟動子, 該啟動子由雞actin啟動子和cmv增強子融合而成，用這一雜合啟動子代替rosa26啟動子，從而高效地啟動目的基因表達。
15、在做條件性基因敲除小鼠模型的設計時，為什麼不能從exon1敲除？
條件性基因敲除小鼠模型的設計，不能從exon1開始敲除，原因是loxp site 最好不要插入到啟動子區域，因為很難**啟動子和所有調控元件的位置，loxp的插入很有可能會因為破壞了啟動子或調節原件而影響野生型蛋白的表達，所以條件性敲除設計中，一般都不會從exon1開始敲除。
16、目前基因沉默小鼠模型存在的缺陷有哪些？
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