生物化學與分子生物學設計實驗
（膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇及二乙醯一肟法測定血清尿素）
小組成員：
班級：麻醉11-2班
日期：2023年12月19
膽固醇氧化酶法測定血清總膽固醇及二乙醯一肟法測定血清尿素
實驗目的
1、掌握酶法測定總膽固醇的原理和方法。
2、學習用比色法測定血清尿素。
3、鞏固有關膽固醇和尿素的知識。
4、進一步熟練uv2100型分光光度計的
重點、難點：
重點：1、氧化酶法測定總膽固醇的原理
2、二乙醯一肟法測定血清尿素的注意事項
難點：氧化酶法測定總膽固醇的原理
一、實驗原理
（一）氧化酶法測定血清總膽固醇
血清總膽固醇(tc)包括：游離膽固醇(fc)和膽固醇酯(ce)兩部分。本實驗是膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶和過氧化物酶相偶聯發生的偶聯反應。
第一步：血清膽固醇酯可被膽固醇酯酶水解為游離膽固醇和游離脂肪酸ffa) 。
第二步：膽固醇在膽固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-膽甾烯酮和h2o2。
第三步：h2o2在4-氨基安替比林和酚存在時，經過氧化物酶催化，反應生成苯醌亞胺非那腙的紅色醌類化合物，其顏色深淺與標本中tc含量成正比。
（二）二乙醯一肟法測定血清尿素
二乙醯在強酸條件下與尿素縮合成紅色的4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，顏色深淺與尿素含量成正比。因二乙醯不穩定，故由試劑中二乙醯一肟與強酸作用產生二乙醯。
二、操作步驟
（一）氧化酶法測定血清總膽固醇
終點法檢測tc，取試管3支按下表依次加樣。
酶法測定tc操作步驟
混勻後，37℃保溫10 min，每管加3ml水混勻，用分光光度計比色，於500 nm波長處以空白管調零，讀出各管吸光度。
（二）二乙醯一肟法測定血清尿素
取試管3支，按下錶依次加樣。
二乙醯一肟法操作步驟
混勻，置沸水浴加熱12min，取出置冷水中冷卻5min，以空白管調零，在540nm處讀取各管吸光度。
三、注意事項
（一）氧化酶法測定血清總膽固醇
1、最後加酶試劑，各管反應時間應一致；
2、比色應在30min內完成；
3、試管在操作前盡量保持乾燥；
4、試劑中酶的質量影響測定結果 ；
5、若需檢測游離膽固醇濃度，將酶試劑成分中去掉膽固醇酯酶即可。
（二）二乙醯一肟法測定血清尿素
1、試劑中加入氨基硫脲和鎘離子，可增進顯色強度和色澤穩定性，但仍有輕度褪色現象，(每小時小於5%)。煮沸顯色經冷卻後，應及時比色。
2、尿液中尿素也可用此法測定，但因濃度高，需先用去離子水作50倍以上稀釋。
3、注意潔淨乾燥，加量務必準確。
4、水浴時注意開啟水浴箱蓋，以免水汽入管。
5、酸性試劑中酸的含量較濃，要小心使用。
四、思考題
1. 血清膽固醇濃度公升高或降低有何臨床意義？
2. 血清尿素濃度公升高或降低有何臨床意義？
3. 血清非蛋白氮(npn)與尿素的區別，它包括哪些？
小結氧化酶法測定血清總膽固醇，此方法特異性好和靈敏度高，既可用於手工操作，也可自動化分析；既可作終點法檢測，也可作速率法檢測。在終點法中血紅蛋白高於2g/l時引起正干擾；膽紅素高於0.1g/l時有明顯負干擾；血中維生素c與甲基多巴濃度高於**水平時，會使結果降低。
但是在速率法中上述干擾物質影響較小。高tg血症對本法無明顯影響。檢測tc的血清(漿)標本密閉儲存時，在4℃可穩定1周，－20℃可穩定半年以上。
二乙醯一肟法測定血清尿素，試劑單一，方法簡便，但試劑具毒性和腐蝕性。在標本數量多時加熱開始難以達到100℃，各管間受熱溫度也可能不一致，因而本法重複性不佳。若改善加熱條件，如採用在水浴鍋底部加置高約5mm的網墊，在網墊上加熱顯色，可使cv由不加網墊時的6.
46%降至2.99%。線性上限僅達7.
14mmol/l；**率為96%～102.1%。二乙醯一肟法的主要干擾來自血清中存在的含氮化合物。
很多其它化合物在結構中會有尿素的殘基，如瓜氨酸、四氧嘧啶和尿囊素，雖然也會產生一種帶顏色的產物，但這些化合物在血清中濃度很低，故很少引起明顯的干擾。另一些其它的化合物在血清中濃度高，但這些色素的最大吸收峰不同，因此不產生明顯干擾。膽紅素達171μmol/l、血紅蛋白達10g/l均無影響。
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