一、usp方法
5.2.12抗iia活性（20.0~35.0iu/mg）
5.2.12.1儀器：紫外可見分光光度計、低溫迴圈槽、電子天平
5.2.12.2試液：
醋酸溶液：取冰乙酸42ml於100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。
ph7.4聚乙二醇6000緩衝液：稱取三羥甲基氨基甲烷6.
08g和氯化鈉8.77g於1000ml容量瓶中，加水500ml溶解後，加聚乙二醇6000 1.0g，用鹽酸調節ph至7.
4，加水稀釋至刻度。
ph7.4緩衝溶液：稱取三羥甲基氨基甲烷6.08g和氯化鈉8.77g於1000ml容量瓶中，加水500ml溶解後，用鹽酸調節ph至7.4，加水稀釋至刻度。
ph 8.4緩衝溶液：稱取三羥甲基氨基甲烷3.
03g、氯化鈉5.12g和乙二胺四乙酸二鈉1.40g於500ml容量瓶中，加水250ml溶解後，用鹽酸調節ph至8.
4，加水稀釋至刻度。
抗凝血酶iii溶液：取1支抗凝血酶iii，加水溶解成5units/ml。用ph7.4聚乙二醇6000緩衝液稀釋成0.5unit/ml。
人凝血酶溶液：用水將人凝血酶復溶，用ph7.4聚乙二醇6000緩衝液稀釋成5units/ml。
顯色底物：選擇適合凝血酶的阿公尺酚試驗的顯色底物，用水稀釋成濃度約3mmol/l。臨用前用ph 8.4緩衝溶液稀釋至0.5 mmol/l。
標準溶液：用ph 7.4緩衝溶液將usp依諾肝素鈉活性標準品稀釋為濃度0.015~0.070uspiu/ml之間的四個濃度梯度。
樣品溶液：用ph 7.4緩衝溶液將依諾肝素鈉樣品稀釋為與標準溶液濃度一致的濃度梯度。
5.2.11.
3檢測過程：取18支檢測管，b1、b2為空白；t1、t2、t3、t4為樣品溶液，各雙份平行；s1、s2、s3、s4為標準溶液，各雙份平行。按b1、s1、s2、s3、s4、t1、t2、t3、t4、t1、t2、t3、t4、s1、s2、s3、s4、b2的順序，每管中加入抗凝血酶iii的體積為v（20~50μl），和同樣體積的ph 7.
4緩衝溶液（空白）、標準溶液或樣品溶液；混合，但不要產生氣泡。於37℃溫浴1分鐘。向每管中加入2v人凝血酶溶液（40~100μl），溫浴1分鐘。
再加入5v顯色底物（100~250μl），4分鐘後加入5v的醋酸溶液（100~250μl）終止反應。以b1為空白，用紫外可見分光光度計在405nm處測量光吸收。空白b2的吸收值相比b1不得超過±0.
05。5.2.12.4計算
對每個濃度系列，將光吸收回歸，與樣品溶液和標準溶液的濃度對數值作線性分析。然後以量平行線分析統計方法計算每ml中依諾肝素鈉抗iia因子iu活性。4個濃度溶液的計算值組合計算得到最終的平均值，然後計算可信限度。
抗iia因子用iu/mg表示，按乾品計。兩人結果的相對平均偏差不得超過5.0%。
5.2.13抗xa因子活性（90~125iu/mg）
5.2.13.1儀器：紫外可見分光光度計、低溫迴圈槽、電子天平
5.2.13.2試液：
醋酸溶液、ph7.4聚乙二醇6000緩衝液、ph7.4緩衝溶液、ph 8.4緩衝溶液同抗iia因子檢測。
抗凝血酶iii：取1支抗凝血酶iii，加水溶解成5units/ml。用ph7.4聚乙二醇6000緩衝液稀釋成1.0unit/ml。
xa因子溶液：用ph7.4聚乙二醇6000緩衝液稀釋，使之在下述檢測中405nm處光吸收每分鐘增加不超過0.20，但要用體積為v的 ph7.4的緩衝液代替依諾肝素鈉溶液。
顯色底物：選擇適合xa因子的阿公尺酚試驗的顯色底物，用水稀釋成濃度約3mmol/l。臨用前用ph 8.4緩衝溶液稀釋至0.5 mmol/l。
標準溶液：用ph 7.4緩衝溶液將usp依諾肝素鈉活性標準品稀釋為濃度0.076~0.180 usp iu/ml之間的四個濃度梯度。
樣品溶液：用ph 7.4緩衝溶液將依諾肝素鈉樣品稀釋為與標準溶液濃度一致的濃度梯度。
5.2.13.
3檢測過程：取18支檢測管，b1、b2為空白；t1、t2、t3、t4為樣品溶液，各雙份平行；s1、s2、s3、s4為標準溶液，各雙份平行。按b1、s1、s2、s3、s4、t1、t2、t3、t4、t1、t2、t3、t4、s1、s2、s3、s4、b2的順序，每管中加入抗凝血酶iii的體積為v（20~50μl），和同樣體積的ph 7.
4緩衝溶液、標準溶液或樣品溶液；混合，但不要產生氣泡。於37℃溫浴1分鐘。向每管中加入2vxa因子溶液（40~100μl），溫浴1分鐘。
再加入5v顯色底物（100~250μl），4分鐘後加入5v的醋酸溶液（100~250μl）終止反應。以b1為空白，用紫外可見分光光度計在405nm處測量光吸收。空白b2的吸收值相比b1不得超過±0.
05。5.2.13.4計算
對每個濃度系列，將光吸收的回歸，與樣品溶液和標準溶液的濃度對數值作線性分析。然後以量平行線分析統計方法計算每ml中依諾肝素鈉抗xa因子iu活性。4個濃度溶液的活性對數值組合計算得到最終的幾何平均值，同時計算可信限度。
抗xa因子用iu/mg表示，按乾品計。兩人結果的相對平均偏差不得超過2.0%。
二、ep方法
5.2.14 抗fxa因子和抗fⅱa因子活性檢測：（2人檢測）
5.2.14.1.溶液的配製
5.2.14.1.1緩衝液的製備
5.2.14.1.1.1三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩衝液(ph 7.4)：
溶解三羥甲基氨基甲烷6.08g和氯化鈉8.77g於純化水500ml中，加牛血清蛋白10g。
用鹽酸（取濃鹽酸85 ml用蒸餾水稀釋到1000 ml，以下所用鹽酸無特殊要求外，指此濃度鹽酸）調節ph至7.4，用純化水稀釋到1000 ml。
5.2.14.1.1.2 三羥甲基氨基甲烷-edta緩衝液(ph 8.4)：
溶解氯化鈉5.12g和三羥甲基氨基甲烷3.03g和edta二鈉1.4g於純化水250ml中。用鹽酸調節ph至8.4，用純化水稀釋到500 ml。
5.2.14.1.2顯色底物的製備：
5.2.14.1.2.1顯色底物r1(n-α-苄氧基羰基-d-精氨醯基-l-甘氨醯基-l-精氨酸-4-硝基苯胺的二氫氯化物)：
顯色底物s-2765：用水溶解顯色底物成3mmol/l的溶液。臨用前用三羥甲基氨基甲烷-edta緩衝液(ph 8.4)稀釋成0.5mmol/l的溶液。
5.2.14.1.2.2顯色底物r2(d-苯基丙氨醯基-pipecolyl-l-精氨酸-4-硝基苯胺的二氫氯化物水溶液)：
顯色底物s-2238：用水溶解顯色底物成3mmol/l的溶液。臨用前用三羥甲基氨基甲烷-edta緩衝液(ph 8.4)稀釋成0.5mmol/l的溶液。
5.2.14.1.3牛xa因子參照液的製備：
xa因子溶液：取xa因子1瓶，加ph7.4緩衝液10ml溶解並稀釋。
5.2.14.1.4 antithrombin(抗凝血酶)：
用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩衝液(ph 7.4)配製成含5iu/ml的溶液，在2~8℃下儲存。
5.2.14.1.5 thrombin：用ph7.4緩衝液稀釋至5iu/ml，2~8℃下儲存。
5.2.14.1.6抗凝血酶ⅲ r1參照標準品的製備：
用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩衝液(ph 7.4)配製成含1iu/ml的溶液。
5.2.14.1.7抗凝血酶ⅲr2參照標準品的製備：
用三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩衝液(ph 7.4)配製成含0.5iu/ml的溶液。
5.2.14.1.8 30%乙酸：
量取冰乙酸30ml於100ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻即得。
5.2.14.2. 抗fxa因子活性檢測：（抗fxa因子活性90iu/mg～125iu/mg）
5.2.14.2.1反應原理
低分子肝素（lmwh）+抗凝血酶（at過量）低分子肝素·抗凝血酶的複合物（lmwh-at）
低分子肝素·抗凝血酶複合物（lmwh-at）+fxa (fxa過量) lmwh·at·fxa +fxa(剩餘)
顯色底物r1（s-2765）肽（peptide）+pna
pna在405nm處有吸收特性。
5.2.14.2.2檢測
5.2.14.2.2.1標準液的配製
根據原標準液的抗xa因子的濃度（104iu/安瓿），加超純水1ml配成約含104iu/ml貯備液，使用之前用ph7.4的緩衝液稀釋成最大濃度0.18iu/ml、劑間比為0.
75的四個濃度的對照液，分別記為s1、s2、s3和s4。
稀釋方法：取104iu/ml標準液0.0962ml於25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得0.400iu/ml標準液。
0.400iu/ml0.180iu/ml
0.180iu/mliu/ml
0.180iu/ml0.101iu/ml
0.180iu/ml0.076iu/ml
5.2.14.2.2.2樣品溶液的配製：
首先估測樣品的抗fxa因子含量（iu/mg），根據估測樣品的抗fxa因子含量將樣品用用ph7.4的緩衝液稀釋成與標準溶液相一致的四個濃度的檢測液，分別記為t1、t2、t3和t4。
稀釋方法：將樣品稀釋為50iu/ml，取此溶液1.0ml於25ml容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，得2.00iu/ml樣品液。
2.00iu/ml0.180iu/ml
0.180iu/mliu/ml
0.180iu/ml0.101iu/ml
0.180iu/ml0.076iu/ml
5.2.14.
2.2.3準備18支試管，t1、t2、t3和t4表示為檢測樣品，s1、s2、s3 和s4表示參照品，a01、a02作為空白，按a01，s1，s2，s3，s4，t1，t2，t3，t4， t1』、t2』、t3』，t4』，s1』，s2』，s3』，s4』，a02的順序每支管中加入抗凝血酶ⅲ r1參照品溶液50μl，分別加入檢測樣品液或參照品液或三羥甲基氨基甲烷的氯化鈉緩衝液(ph 7.
4)（檢測空白）50μl，用相同方法檢測空白開始時和結束時的吸收度，兩次空白檢測的吸光度相差不超過±0.05。每一支加完後，混合但不能產生氣泡。
5.2.14.
2.2.4在37±0.
2℃下保溫1min，每支管加入牛抗xa r參照品液100μl，保溫1min，加入顯色底物r1250μl。在37±0.2℃準確保溫4min，最後加入30%乙酸溶液375μl。
5.2.14.
2.2.5移取反應混合液至半微量比色皿在405nm處以30%的乙酸溶液為參比，用紫外可見分光光度計檢測吸收度，a01與a02的吸光度不得有顯著差異，應在1小時內檢測。
5.2.14.2.2.6結果計算：使用中國藥典生物檢定統計程式bs2000軟體計算得出樣品的抗xa因子含量。平均可信限率 fl %應小於 15%。
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