傳代培養法
原理細胞在培養瓶長成緻密單層後，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。 傳代培養也是一種將細胞種儲存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。
懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化後才能分瓶。
材料和試劑
1. 細胞：貼壁細胞株
2. 試劑：0.25％胰酶、1640培養基（含10％小牛血清）
3. 儀器和器材：倒置顯微鏡，培養箱、培養瓶、吸管、廢液缸等
操作步驟
1. 吸除培養瓶內舊培養液。
2. 向瓶內加入胰蛋白酶和edta混合液少許，以能覆滿瓶底為限。
3. 置溫箱中2~5分鐘，當發現細胞質回縮，細胞間隙增大後，立即終止消化。
4. 吸除消化液，向瓶內注入hanks液數毫公升，輕輕轉動培養瓶，把殘餘消化液沖掉。注意加hanks液沖洗細胞時，動作要輕，以免把已鬆動的細胞沖掉流失，如用胰蛋白酶液單獨消化，吸除胰蛋白酶液後，可不用hanks液沖洗，直接加入培養液。
5. 用吸管吸取營養液輕輕反覆吹打瓶壁細胞，使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6. 計數板計數後，把細胞懸液分成等份分裝入數個培養瓶中，置溫箱中培養
無菌操作注意事項
1. 操作前要洗手，進入超淨台後手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2. 點燃酒精燈，操作在火焰附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼時間不能太長，以免退火，並冷卻後才能夾取組織，吸取過營養液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜。
3. 操作動作要準確敏捷，但又不能太快，以防空氣流動，增加汙染機會。
4. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5. 瓶子開口後要盡量保持45℃斜位。
6. 吸溶液的吸管等不能混用。
無菌操作體外培養細胞缺乏抗感染能力，所以防止汙染是決定培養成功或失敗的首要條件。即便使用裝置完善的實驗室。若實驗者粗心大意，技術操作不規範,也會導致汙染。
因而．為在一切操作中為最大可能的保證無菌．每一項工作都必須做到有條不紊和完全靠。
【培養前準備】在開始實驗前要制定好實驗計畫和操作程式。有關資料的計算要事先做好。根據實驗要求，準備各種所需器材和物品、清點無誤後將其放置操作場所(培養室、超淨臺)內，然後開始消毒。
這可以避免開始實驗後．囚物品不全往返拿取而增加汙染機會。
【操作野消毒】無菌培養室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)．紫外線照射消毒30-50min，超淨工作台檯面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然後紫外線淌毒30min。
在工作檯面消毒時切勿將培養細胞和培養用液同時照射紫外線，消毒時工作台面上用品不要過多或重疊放置．否則會遮擋射線降低消毒效果。—些操作用具如移液器、廢液缸、汙物盒、試管架等用75%酒精擦洗後置於台內同時紫外線消毒。
【洗手和著裝】原則上和外科手術相同。平時僅做觀察不做培養操作時，可穿裝細胞培養室內紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超淨臺工作時，因整個前臂要伸入箱內，應著長袖的清潔工作服，並於開始操作前要用75％酒精消毒手。
如果實驗過程中手觸及可能汙染的物品和出入培養室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。
【火焰消毒】 在無菌環境進行培養或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈或煤氣燈。以後一切操作，如按裝吸管帽、開啟或封閉瓶口等，都需在火焰近處並經過燒灼進行。但要注意：
金屬器械不能在為焰中燒的時間過長，以防退火，燒過的金屬鑷要待冷卻後才能挾取組織，以免造成組織損傷。吸取過營養液後的吸管不能再用火焰燒灼，因殘留在吸管頭中營養液能燒焦形成炭膜，再用時會把有害物帶入營養液中。開啟、關閉長有細胞的培養瓶時，火焰滅菌時間要短。
防止因溫度過高燒死細胞。另外膠塞過火焰時也不能時間長，以免燒焦產生有毒氣體，危害培養細胞。
【操作】 進行培養時，動作要準確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加汙染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原則上應是右手使用的東西放置在右側，左手用品在左側，酒精燈置於**。
工作由始至終要保持一定順序性，組織或細胞在未做處理之前，勿過早暴露在空氣中。同樣，培養液在未用前，不要過早開瓶；用過之後如不再重複使用，應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。吸取營養液、pbs、細胞懸液及其它各種用液時，均應分別使用吸管，不能混用，以防擴大汙染或導致細胞交叉汙染。
工作中不能面向操作野講話或咳嗽，以免唾沫把細菌或支原體帶入工作檯面發生汙染。操作前用酒精擦拭超淨檯面及雙手。手或相對較髒的物品不能經過開放的瓶口上方，瓶口最易汙染，加液時如吸管尖碰到瓶口，則應將吸管丟掉
1.玻璃吸管和玻璃培養瓶的消毒:1)高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;2)乾烤消毒140度2小時以上;
2.無菌工作台先清洗後用75%酒精擦拭乾淨,紫外線照射40分鐘以上;各種培養板照射3小時以上;
3.培養基(ph7.2)和血清配製好後要做無菌試驗:
將血清按10%加入培養基內,用無菌的玻璃離心管或玻璃瓶取完全培養基5-10ml置培養箱內培養2-3天,肉眼見無渾濁或沉澱等異物.分裝後置-20度儲存;
4.消化液(ph7.8)或其它加入液,應用高壓蒸汽滅菌或一次性無菌濾器過濾除菌,分裝成支置-20度儲存;
5.各種炒嫻囊禾寧次率庇ρ咭」呷諢?否則有的液體(特別是培養基)容易產生沉澱.
6.培養箱應先用清水清洗後用75%酒精擦拭一遍(如有紫外線的應照射1小時以上,如有高溫滅菌的應按程式來菌).至少每月一次.
7.進入操作時應注意先清洗雙手及手腕,然後用75%酒精擦拭,操作時注意無菌台內空間層次.手及物品不要在暴露的瓶口上方來往,如果數量較多,培養瓶應放在與酒精燈平行地方便於操作,瓶與瓶之間應相隔一定的距離,開瓶(蓋)時應先用75%酒精反覆擦拭或用燈燒,開開後應用燈先燒口,然後燒蓋.
用完後同樣操作.整個操作過程盡量在無菌臺靠裡面一點.
復甦:1.應遵守慢凍快融的原則.先將水溫鍋調至37-37.5度,取出凍存的細胞迅速放入後交細胞麵浸至水面以下不斷搖動至融化.
2.在無菌台內將完全培養基加入50ml的小培養瓶內,約5ml左右,然後用無菌吸管從凍存管內取出細胞,置培養並內輕輕搖晃,使細胞均勻後置培養箱內培養.
傳代:1.貼壁細胞:
對於貼壁細胞應先吸(倒)盡培養基,吸的越乾淨越好,以免中和後加入的消化液,使強度減弱.50ml培養瓶加入消化液約0.6ml,按此比例進行消化,(根據配製強度經驗),晃動使消化液鋪均勻置37度培養箱約2分鐘,鏡下見細胞收縮變圓或少數脫落後,輕輕振動瓶底使細胞全部脫落,加入2-3ml完全培養基後,輕輕吹打,使細胞基本成單個懸浮,然後分置其它無菌培養瓶內,加入完全培養基後繼續培養或實驗.
2.懸浮細胞:
一般傳代可直接將細胞原液分置其它培養瓶內,加入完全培養基繼續培養,如要高濃度可先離心500rpm,5min後加入完全培養基,輕輕吹勻後,分置其它培養瓶內加入完全培養基繼續培養.
細胞培養基本方法
一 準備和安裝過濾器 清洗好過濾器，乾燥，放入一張孔徑0.22 m的微孔濾膜，用布包裝好，15磅20 min進行高壓滅菌處理。在超淨台內開啟過濾器架好，膠管一端接入濾幫浦再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中。用幫浦過濾，過濾後要檢查濾膜是否完好無損。二 合成培養基的配製 1 根據細...
細胞培養室配置
新中新藥研究開發中心 科 我中心擬建立細胞培養室，現向你處提供所需配置清單如下。請提供有關裝置的產品介紹書和 供我們選擇。一儀器裝置 1 冷凍高速離心機1臺 2 消毒櫃 50l1臺 3 超聲清洗機1臺 4 普通冰箱 冷藏4 c 冷凍 20 c1臺5 液氮罐 儲存罐 50 l2個 運輸罐 杜瓦瓶1個 ...
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