一． 名詞解釋
1. 細胞系
原代培養物經首次傳代成功後即成細胞系。由原先存在於原代培養物中的細胞世系所組成。如果不能繼續傳代或者傳代數有限，稱為有限細胞系；如果可以連續傳代，則稱為連續細胞系。
2. 細胞株
通過選擇法或轉殖形成法從原代培養物或細胞系中獲得的具有特殊性質或標誌的培養物稱為細胞株。細胞株的特殊性質或標誌必須在整個培養期間始終存在。如果不能繼續傳代或傳代代數有限，可稱為有限細胞株；如果可以繼續傳代，則稱為連續細胞株。
3. 細胞轉殖
轉殖本身的含義是無性繁殖，即由同乙個祖先細胞**繁殖而形成的純細胞系，該細胞系中每個細胞的基因彼此相同。在動物細胞培養中指由單個細胞通過有絲**形成的細胞群體。乙個轉殖不一定是均質的。
4. 原代培養
是指直接從機體取下細胞、組織和器官後立即進行培養。因此，較為嚴格地說是指成功傳代之前的培養，此時的細胞保持原有細胞的基本性質。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養細胞統稱為原代細胞培養。
5. 細胞傳代
培養細胞的生存空間和營養是有限的，當細胞增殖達到一定密度後，需要分離出一部分細胞和更新營養液，這一過程稱為傳代。
6. 骨髓間充質幹細胞
它是存在於骨髓中的另一種非造血幹細胞，可發育成骨、軟骨、脂肪、肌肉和內皮細胞等細胞，無發育成完整個體的能力，發育潛能受到一定的限制，屬於多能成體幹細胞。
7. 幹細胞
指具有無限制**能力，同時可分化成特定表型的細胞，在細胞生物發育階段屬於較原始時期階段的細胞。按其分化能力可分為全能性幹細胞（胚胎幹細胞）：具有完全能力的細胞，每個細胞均可發育成乙個完整的生物個體；多能性幹細胞（成體幹細胞）：
胚胎幹細胞繼續進行分化，形成具有特定功能的幹細胞，這些專門化的幹細胞統稱多能幹細胞，不能發育成完整的生物個體。
一．光學顯微鏡解析度決定因素
解析度是指能被顯微鏡清晰區分的兩個物點的最小間距。其計算公式為：r=0.
61λ/nsinα=0.61λ/na。所以影響解析度的因素是入射光的波長、介質的折射率以及入射光的角度即鏡頭的數值口徑。
二．細胞生長期，貼壁期
細胞生長期又稱對數期。此期的細胞增殖旺盛，成倍增加，活力最佳，適用於進行實驗研究。在此階段，若細胞處於理想的培養條件，將不斷增殖，細胞數量日漸增加，細胞將接觸而連成一片，一段時間後，細胞因接觸抑制而停止運動，密度抑制而細胞終止**，細胞不再增殖而進入平台期。
貼壁期：細胞附著於底物上後游離期結束，進入貼壁期。血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白、纖粘素和膠原等醣蛋白（生長基質），這些帶正電荷的醣蛋白作為促貼壁因子先吸附於底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的底物附著。
三．原代培養具體操作（以小鼠腎臟細胞培養為例）
1. 取材：將乳鼠脫頸處死，浸入75%酒精消毒。
拿到超淨工作台上，再次用酒精棉球消毒背部**，而後剪開**取出腎臟。剪去腎膜和脂肪，用pbs洗三次，剪下腎組織，去掉腎盂。將腎塊移入小燒杯中，剪成均勻碎塊，用pbs清洗至無血球為止。
之後移入離心管中，用吸管吸出剩餘pbs。
2. 消化：用吸管吸取適量0.
25%胰蛋白酶加入離心管中，與組織混勻蓋上蓋，放入37℃水浴中消化10-30min，不斷搖動使組織與消化液充分接觸，消化至組織變白，較疏鬆為止。離心後，吸出消化液，加入含10%小牛血清的mem培養液，用吸管吹打使其成細胞懸液。用濾網過濾除掉沒能消化的大組織塊。
3. 培養：在分散好的細胞懸液中加入胎盤蘭染色劑染色進行計數，根據細胞密度調集成適的細胞數分裝到培養瓶中，注意標註好名稱日期，之後放入co2培養箱中培養。
四．傳代培養具體過程
1. 吸除或倒掉舊培養液；
2. 加入2ml，無鈣、鎂pbs，漂洗一次後倒掉；
3. 加入1ml消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%edta或混合液）；
4. 肉眼可觀察到「薄膜」現象時，倒掉消化液，並繼續作用2—3min；
5. 顯微鏡下可發現細胞回縮變圓，細胞間隙增大，此時應立刻終止消化；
6. 加入完全培養基5ml，用吸管反覆吹打；
7. 計數板計數後按照合適的密度分瓶培養。
五．細胞培養過程的汙染
細胞培養中的汙染問題包括細菌等微生物的汙染、不同細胞型別的交叉汙染及有害物質的汙染。
體外培養的細胞由於缺乏機體的免疫系統等機制而失去對微生物的防禦能力，若發生細菌等微生物的汙染，細胞最終會死亡。可能導致微生物的汙染包括細菌、黴菌及支原體。
不同細胞型別的交叉汙染可使實驗室原來的細胞系失去原有特性，因此也應引起足夠重視。為了避免交叉汙染，對不同細胞系操作時要特別注意，例如：避免使用同一瓶培養液及試劑；已曾伸入一種細胞培養瓶中的吸管不應再放置於培養液瓶中等。
六．動物細胞培養注意事項
1. 在培養過程中的細胞汙染問題。為了防止細胞被汙染，在實驗前就應做好清潔滅菌措施，還要在實驗過程中嚴格採用無菌操作技術。
（1）實驗前所用的器材以及溶液含有細菌，因此在實驗前需要做好清潔滅菌工作：
① 實驗器材的清洗需嚴格按照清洗方法和流程進行。
② 清洗完成後要用牛皮紙包紮瓶口，以防細菌進入瓶內，之後還需進行消毒滅菌。
③ 實驗所需溶液使用前先通過濾器過濾，除去溶液內的細菌。
④ 培養基和血清配製好後要做無菌試驗檢測是否還殘存細菌。
（2）通過無菌操作技術可預防實驗過程中的細菌汙染：
① 實驗開始前開啟超淨工作台的紫外燈消毒20min左右；
② 用肥皂仔細清洗雙手，並且用75%酒精棉球擦手；
③ 啟開瓶蓋時，在微藍色的火焰上轉動瓶子，使瓶口均勻接觸火焰防止空氣中的細菌進入。
④ 取吸管時不要碰到其它吸管，也盡量不要觸碰管身，並且安乳頭時吸管需經過火焰，不要被手汙染。
⑤ 禁止兩手臂在臺面上交叉取物，禁止在開蓋的物品、培養液上方活動，以防止身上的細菌掉入培養液中。
⑥ 空氣中有微生物，因此不能過早開蓋。
2. 用酶法分離細胞時，注意酶液的濃度和消化時間的控制；貼塊法分離細胞時，注意動作要輕柔，不要傷到細胞組織，組織塊邊緣盡量平整有利於細胞游離。
3. 在原代培養的1天到2天內，要特別注意觀察是否有細菌、真菌的汙染，一旦發現，要及時清除，防止造成其它細胞的交叉感染；
4. 在細胞培養的過程中，要注意培養液顏色的變化，並根據培養液的顏色來決定換液時間。換液過程中，不要吸出細胞，不要使培養液溢位培養瓶，以避免各種微生物的汙染。
換液時，應將培養液事先預溫至37℃。
5. 離體培養的細胞生命力比較脆弱，因此傳代時細胞沒有生長到培養瓶底壁面積的80%以前，不要急於傳代。
6. 對貼壁細胞消化後的吹打過程要有序進行，確保瓶皿底壁各處的細胞都被吹打脫離。吹打時動作不宜過猛，否則會直接損傷細胞並產生能傷害細胞的氣泡。
七．細胞凍存復甦的方法和基本原理
1. 細胞凍存原理：凍存細胞時要緩慢凍存。
當細胞冷到零度以下，細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度公升高，並在細胞內形成冰晶。如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反，結晶就大，大結晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。在細胞凍存時加入低溫保護劑（如甘油和dmso），能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護劑dmso，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高細胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。
2. 細胞凍存方法：
1 取對數生長期細胞，用胰蛋白酶把單層生長的細胞消化下來，依據傳代方法把消化好的細胞收集於離心管中並計數。離心1000r/min，5min。
2 去除胰蛋白酶及舊培養液，加入配置好的凍存液（含10%dmso或甘油），用吸管吹打製成細胞懸液。分裝入無菌凍存管中，密封後標記冷凍細胞名稱和冷凍日期。
3 -70℃放置2-3h，之後再移入液氮罐中凍存。
3. 細胞復甦原理：復甦應採取快速融化的手段，這樣可以保證細胞外結晶在很短時間內即融化。避免由於緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損害。
4. 細胞復甦方法：
1 取出凍存管直接投入37℃溫水中，並輕輕搖動令其盡快融化
2 從水浴中取出凍存管，酒精消毒後開啟，吸出細胞懸液，注入離心管並滴加10倍以上的培養液（稀釋保護劑dmso，減少其對細胞的損傷），混合後低速離心去除上清液，再重複清洗一次。
3 培養液進行適當稀釋，接種到培養瓶繼續培養。
八．人臍靜脈細胞的分離提取及鑑定
1. 分離提取
① 取材：無菌條件取新生兒臍帶10cm，在超淨台內剔除鉗痕和凝血塊阻塞部分。
② 沖洗：在盛有提前預熱的pbs培養皿中初步浸洗，找到臍靜脈（2根管腔較小的是臍動脈，1根管腔較粗的是臍靜脈）後用50ml注射器吸取預熱的溫pbs液進行灌注沖洗，直至洗淨血後用止血鉗封住臍帶一端。
③ 消化及離心：用注射器從另一端注入15mlⅱ型膠原酶進行消化，培養箱中反應15min，期間適當翻動臍帶。消化完畢後，開啟止血鉗，剔除鉗痕，收集臍靜脈內的消化液，然後注入含10%胎牛血清的培養液，再次沖洗管腔，將消化液與沖洗液一併收集於離心管中。
1000r/min離心5min。離心完成後，去掉上清液。
④ 原代培養：加入rpme1640完全培養液，用巴氏吸管輕輕的吹打均勻，然後接種於培養瓶中，置於5%c02、37℃培養箱中培養，24h後更換培養液去除未貼壁的細胞，然後每隔24h定量換液1次至細胞生長鋪滿瓶底。
⑤ 傳代培養：細胞長滿後可用常規胰蛋白酶消化法傳代培養。
2. 細胞鑑定：人臍靜脈內皮細胞第8因子相關抗原免疫組織化學染色可見細胞呈圓形、梭形或多邊形，胞漿內可見棕黃色顆粒，核周密集，而對找組未見染色。則可證培養細胞為內皮細胞。
九．胚胎幹細胞的分離提取及鑑定
1. es細胞的分離提取：
（1）獲取早期胚胎
獲取早期胚胎：不同動物獲取早期胚胎的時間不同，主要考慮以下因素：
①所取胚胎在條件允許的情況下，細胞盡可能的多。
②在體外易於培養增殖並能保持多能性。除從動物體內直接獲取新鮮胚胎外，體外受精所得胚胎與核移植所得的重構胚亦可作為es細胞分離轉殖的原材料
（2）早期胚胎培養及細胞團的獲取
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