生物工程專業
張如新、任光雲編著
邵陽學院生物與化學工程系
2023年10月
目錄實習專案
一、超臨界co2萃取山茱萸中有效成分熊果酸………………1
實習專案
二、加攜帶劑超臨界co2萃取山茱萸有效成分熊果酸………5
實習專案
三、hplc法測定萃取物中有效成分熊果酸的含量…………7
實習專案
一、山茱萸有效成分熊果酸的超臨界co2萃取
一、實驗目的與要求
1、掌握超臨界co2萃取的原理
2、掌握超臨界co2萃取的操作
3、掌握材料的處理與準備
二、原理
超臨界co2萃取是利用欲分離物質與雜質在超臨界co2中溶解度不同而達到分離的一種萃取技術。超臨界流體兼有氣、液兩者的特點，密度接近於液體，粘度和擴散係數接近於氣體，它不僅具有與液體溶劑相當的溶解能力，而且具有優良的傳質效能。超臨界流體co2萃取技術就是利用這種超臨界流體的特殊性質，在高壓條件下與待分離的固體或液體混合物接觸，有效成分能溶解在超臨界流體co2，通過調節系統的操作壓力和溫度，可萃取所需要的物質。
隨後通過降壓或公升溫的方法，降低超臨界流體co2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物與超臨界流體分離，萃取得到有效成分即目的物。
三、材料與儀器
1、材料：山茱萸
2、co2氣體
3、儀器： 超臨界co2萃取裝置
4、植物樣本粉碎機
四、操作步驟
1、材料的準備
選擇優質的山茱萸材料，把其中的雜質去掉，稱取1公斤山茱萸在70~100c烤箱中烘烤3~4小時至完全乾燥為止。用粉碎機粉碎（過40目篩），粗粉要再次粉碎，直到能過40目篩。
2、萃取
稱取100 g 粉碎的山茱萸裝入萃取缸並把萃取缸安裝好，在壓力為30mpa、溫度為40c下萃取3~4小時。並按co2超臨界萃取裝置使用說明書（見附頁）開機進行萃取操作：（注意：
一定要在熟練掌握原理和操作規則情況下才正式開機操作。）
3、收集萃取物
在收集萃取物之前，應準備4個洗乾淨並烘乾的250ml 錐形瓶。每萃取1個小時收集一次，具體操作按說明書。最後收集完後，用封口膜封好錐形瓶，貼好標籤並標好組號，時間等。
儲存好以備後面實驗。
4、記錄
應認真記好實驗資料，包括實驗的條件（如萃取溫度、壓力、萃取時間等），實驗結果和實驗現象等。
5、儀器清理
做完實驗後，應依次用自來水，蒸餾水和無水乙醇清洗萃取缸和分離缸。清理打掃實驗現場，包括實驗台衛生，實驗室衛生。特別提醒注意關掉萃取裝置總電源。
附頁co2超臨界萃取裝置使用說明書
第一步：放空（關v28）
關v28、v25及v11，開啟v24（可同時開啟萃取缸下的開關v8）把萃取缸中的co2放乾淨，至萃取壓力為零。如果不放空萃取缸取不下來，沒放空co2取下萃取缸很危險。 關掉v25和v11時分離缸ⅰ和分離缸ⅱ不需放空。
如需放空分離缸ⅰ和分離缸ⅱ，則不要關v25和v11，也可同時開啟分離缸ⅰ和分離缸ⅱ下面的開關。
第二步裝料
當萃取缸壓力為零時，取下萃取缸，稱取一定量的粉碎樣品裝入萃取缸，再按要求裝好萃取缸，一定要擰緊螺栓。
第三步萃取
1、開電源
2、開鋼瓶（開到底再倒擰一圈）
3、開啟v1和v28
4、開總電源，至三相電源指示燈全亮
5、開冷迴圈、製冷開關。
6、開萃取、分離ⅰ和分離ⅱ開關，並調節設定溫度。
7、當溫度達到設定溫度後，開主幫浦開關，有顯示後開run開關，主幫浦運轉。開v25調節壓力至設定壓力並穩定此壓力，開v11調節壓力至8mpa。
8、當壓力平衡後，關v1（co2在裝置內反覆迴圈，）
如果壓力過大，超過設定的安全壓力時，主幫浦開關自動停止，此時需再次開啟主幫浦開關，調節壓力。
9、萃取開始，並記錄時間，萃取一定時間後，定時取樣。
10、取樣時，開關稍開啟，不能開啟太大，邊開邊關。一次萃取完時，若繼續萃取，應先關主幫浦開關，開啟v1、v25、v11。讓co2回流至鋼瓶，並使各部分壓力平衡，即萃取缸壓力=分離ⅰ=分離ⅱ=貯罐壓力。
11、關v1、v25、v28後，使萃取缸放空，開v8讓萃取缸放空，也可以放v24讓萃取缸放空。
第四步攜（夾）帶劑萃取
1、關v1，量取一定的攜帶劑加入後面的攜帶劑罐中。
2、開啟v7和副幫浦開關。再開啟後面的副幫浦放氣閥，排除攜帶劑計量器與副幫浦之間的氣體，至有攜帶劑流出時為止，關副幫浦放氣閥。
3、等攜帶劑註完後，關副幫浦和v7。
第五步關機
關掉v1、v25和v 28，開v24放空，再關主幫浦開關、製冷開關、冷迴圈開關、總開關和鋼瓶開關。
實習專案
二、加攜帶劑超臨界co2萃取山茱萸有效成分熊果酸
一、目的與要求
1、掌握co2超臨界萃取原理與操作
2、掌握攜帶劑對萃取結果的影響
3、掌握加攜帶劑co2超臨界萃取的操作
二、原理
超臨界co2萃取是利用欲分離物質與雜質在超臨界co2中溶解度不同而達到分離的一種萃取技術。超臨界流體兼有氣、液兩者的特點，密度接近於液體，粘度和擴散係數接近於氣體，它不僅具有與液體溶劑相當的溶解能力，而且具有優良的傳質效能。超臨界流體co2萃取技術就是利用這種超臨界流體的特殊性質，在高壓條件下與待分離的固體或液體混合物接觸，有效成分能溶解在超臨界流體co2中，通過調節系統的操作壓力和溫度，可萃取所需要的物質。
隨後通過降壓或公升溫的方法，降低超臨界流體co2的密度，使萃取物溶解度降低，使目的物與超臨界流體分離，萃取得到有效成分（即目的物）。攜帶劑是在超臨界萃取過程中為了提高分離效果，在超臨界流體中新增少量的另一種溶劑（如水、乙醇、丙酮等）。使用攜帶劑對結果有明顯的影響。
通常因加入攜帶劑可顯著提高超臨界萃取的分離效果。不同攜帶劑對有效成分的萃取影響不同。通過實驗可以找出有效成分的最佳的攜帶劑。
三、材料、儀器與試劑
1、材料：山茱萸
2、儀器： 超臨界co2萃取裝置、植物樣本粉碎機
3．試劑：乙醇
四、操作步驟（見說明書）
1、材料的準備
選擇好山茱萸材料，把其中的雜質去掉，稱取1公斤山茱萸在70~1000c烤箱中烘烤3~4小時至完全乾燥為止。用粉碎機粉碎（過40目篩），粗粉要再次粉碎，直到能過40目篩。
2、加攜帶劑萃取
稱取100 g 粉碎的山茱萸裝入萃取缸並把萃取缸安裝好，在壓力為30mpa、溫度為400c下、按說明書操作加入100ml無水乙醇攜帶劑。並按co2超臨界萃取裝置使用說明書（見附頁）開機進行萃取操作，萃取3~4小時。（注意：
一定要在熟練掌握原理和操作規則情況下才正式開機操作。）
3、收集萃取物
在收集萃取物之前，應準備4個洗乾淨並烘乾的250ml 錐形瓶。每萃取1個小時收集一次，具體操作按說明書。最後收集完後，用封口膜封好錐形瓶，貼好標籤並標好組號，時間等。
要儲存好以備後面實驗。
4、記錄
應認真記好實驗資料，包括實驗的條件（如萃取溫度、壓力、萃取時間和加入攜帶劑的種類和數量等），實驗結果和實驗現象等。
5、儀器清理
做完實驗後，應依次用自來水，蒸餾水和無水乙醇清洗萃取缸和分離缸。清理打掃實驗現場，包括實驗台衛生，實驗室衛生。特別提醒注意關掉萃取裝置總電源。
實習專案
三、hplc法測定萃取物中有效成分熊果酸的含量
一、實驗目的
1、掌握高效液相色譜（hplc）的原理和操作
2、掌握用高效液相色譜定性和定量分析有效成分
二、原理
高效液相色譜(high performance liquid chromatography，hplc)又稱高速或高壓液相色譜。該方法是吸收了普通液相層析和氣相色譜的優點，經過適當改進發展起來的。它既有普通液相層析的功能(可在常溫下分離製備水溶性物質)，又有氣相色譜的特點(即高溫、高速、高解析度和高靈敏度)；它不僅適用於很多不易揮發、熱分解難的物質 (如金屬離子、蛋白質、肽類、氨基酸及其衍生物、核苷、核苷酸、核酸、單醣、寡糖和激素等)的定性和定量分析，而且也適用於上述物質的製備和分離。
高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等型別。用不同型別的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與其相對應的普通液相層析相似。其不同之處首先是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重複性好，且需在色譜儀中進行；其次是樣品液和流動相溶液在進入色譜柱前，必須超濾處理，這樣可提高色譜柱的使用壽命。
hplc的構造如下：
（一）、進樣系統
採用隔膜注射進樣器或高壓進樣閥完成進樣操作，進樣量是恆定的，在分析操作中通常進樣量是20l。
（二）、輸液系統
包括高壓幫浦、流動相貯存器和梯度儀三部分。
（三）、分離系統
該系統包括色譜柱、連線管和恆溫器等。色譜柱是核心部分，其大小是根據使用目的、樣品數量及其複雜程度決定的。色譜柱長度一般為5～70cm，直徑為1～50mm，通常分析型色譜柱的體積比製備型的小，並偏向細而長，而製備型色譜柱的體積大，直徑也較大。
在hplc中的色譜柱是由優質不鏽鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，柱內裝有直徑為5～10m(分析型)或數十微公尺(製備型)粒度的固定相。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或矽膠構成，它們都有惰性(如矽膠表面的矽醇基團基本已除去)、多孔性(孔徑可達1000)和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬(與氣相色譜中固定相的製備一樣)，或者用化學法偶聯各種基團(如磺酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等)或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。
另外，固定相基質粒度小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論(即塔板理論數n與理論塔板高度h成反比，而理論塔板高度h與顆粒度的平方成正比)分析，基質粒度越小，塔板理論數n就越大。
這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
（四）、 檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器、螢光檢測器三種。
（五）、資料處理系統
該系統可對測試資料進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、製備或鑑定工作能正確開展。
三、操作
1、標準樣器的配製
用電子天平精確稱取熊果酸標準樣品1.5mg置於2mlep管中，用移液器精確量取1ml無水甲醇（色譜純）加入ep管中，使熊果酸充分溶解於甲醇中，即得1.5mg/ml的標準液。
2、樣品的製備
將前面得到的超臨界co2萃取物分別先用色譜純甲醇充分溶解，再定容至50ml、過濾，取濾液2ml置於2ml離心管中，離心5min（10000r/min），取上清液放於2ml離心管中用於hplc定性定量分析。
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