2 細胞生物學研究方法

2021-08-05 20:48:13 字數 1625 閱讀 5282

生命科學是實驗科學,它的很多成果都是通過實驗得以發現和發展的。方法上的突破,對於理論和應用上的發展具有巨大的推動作用。

2.1 顯微成像技術

最早的光學顯微鏡是2023年z.janssen和他的侄子h.janssen共同研製的。

其後,robert hooke和antonie van leeuwenhoek對光學顯微鏡的分辨本領進行了極大的改進,由此發現了細胞。

20世紀30年代發展起來的電子顯微鏡導致細胞結構和功能研究發生了一次革命,使生物學家得以從亞顯微水平上重新認識細胞(圖2-1)。

2.1.3 光學顯微鏡的樣品製備與觀察

由於大多數細胞的成分不影響光線的穿透,無法形成反差,所以在一般光學顯微鏡下,幾乎看不清未經處理的細胞。為了看清細胞內含物,就必須對細胞樣品進行一些特殊的處理,為此建立和發展了樣品的各種製備技術。

■ 樣品的固定(fixation)

● 目的: 生物組織在染色前先進行固定的目的是殺死細胞,穩定細胞的化學成份,並且使樣品硬化以便在進一步的處理和切片時不會受到破壞。

● 做法: 樣品固定的最簡單做法是將樣品直接浸泡在固定液中。固定使得大分子交聯而保持在一定的位置上,不致於在以後的染色等處理過程中移位或丟失而產生人工假象。

一般用具有緩衝作用的醛類固定液,用甲醛或戊二醛作固定劑,能夠與蛋白質的游離氨基形成共價鍵,從而將鄰近的蛋白質分子牢固地交聯在一起。

■ 包埋和切片(embedding and sectioning)

樣品製備的第二步是將固定的組織製備成切片。為此,樣品首先要被包埋在介質中,通常用液態的石蠟或樹脂做包埋劑,使之滲入整塊組織,然後將之硬化成固體的包埋塊,隨後用專門的切片機切割包埋塊,製備成薄切片(圖2-13)。適用於光學顯微鏡觀察的切片厚度為 l~10 μm。

圖2-13 用切片機進行樣品切片

■ 染色(staining)

大多數細胞總重量的70%是水,對可見光幾乎是透明的,只有很少的內含物不透光。染色的目的就是給細胞的不同組分帶上可區別的顏色特徵。19世紀初,發現某些有機染料可染生物組織,並對細胞特殊部位的著色具有選擇性。

如蘇木精(hematoxylin)對負電荷分子有親和性,能顯示出細胞核心酸的分布;酸性染料如伊紅(eosin)可使細胞質染色;蘇丹染料(sudan dyes)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大,所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著色。但對許多染料的特異性染色機理尚不清楚。

■ 細胞化學技術(cytochemistry)

● 採用比有機染料更為特異的染色劑及酶細胞化學方法,可以了解細胞和組織中大致的化學組成,及某些活性基團或酶的存在。

● 為了測定蛋白質、核酸、多醣和脂類,常利用一些顯色劑與所檢測物質中特殊基團的特異性結合,通過顯色劑在細胞中出現的部位和顏色顯示的程度,從而判斷被檢物質在細胞中的分布和含量。例如,利用feulgen反應(圖2-14)可特異性檢測細胞中的dna,pas反應可用於檢測植物中的澱粉、纖維素及動物細胞中的糖原、粘蛋白等。

● 將細胞或組織切片與適宜的底物共同溫育,切片中的酶會水解底物,再將所釋放物質轉變成不溶性有色化合物,後者所在部位即是組織細胞中酶的活性部位。

圖2-14 feulgen反應

■ 放射自顯影(autoradiography)

放射自顯影技術是用感光膠片測定細胞內某種被放射性標記的物質在細胞固定時所在的位置,基本過程如圖2-15 所示。

圖2-15 放射自顯影術

細胞生物學作業

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細胞生物學章節提要第二章細胞生物學研究方法

細胞生物學研究方法 生物技術的發展進步對於理論的研究具有很大的推動作用。顯微成像技術 顯微成像技術包括光學顯微成像技術和電子顯微成像技術 間接成像技術。光學顯微鏡包括了簡單的雙筒顯微鏡 螢光顯微鏡 相差顯微鏡 暗視野顯微鏡。其中雙筒顯微鏡做一般的光學觀察,油鏡放大倍數較大。螢光顯微鏡用於對物質吸收 ...

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