細胞生物學章節提要第二章細胞生物學研究方法

細胞生物學研究方法

生物技術的發展進步對於理論的研究具有很大的推動作用。

顯微成像技術

顯微成像技術包括光學顯微成像技術和電子顯微成像技術、間接成像技術。

光學顯微鏡包括了簡單的雙筒顯微鏡、螢光顯微鏡、相差顯微鏡、暗視野顯微鏡。其中雙筒顯微鏡做一般的光學觀察，油鏡放大倍數較大。螢光顯微鏡用於對物質吸收、運輸及化學物質分布定位的觀察。

相差顯微鏡用於觀察無色、透明、活細胞中的結構。暗視野顯微鏡用於觀察物體的外部輪廓，比如活細胞中的細胞核、線粒體，液體介質中的細菌和黴菌等。光學顯微鏡的樣品製備主要步驟是：

初固定、包埋和切片、染色。也可以通過螢光和放射自顯影術達到觀察的目的。

電子顯微鏡包括透射電子顯微鏡、掃瞄電子顯微鏡、掃瞄透射電鏡、高壓電鏡。透射電子顯微鏡通過電子束通過薄樣品成像（高壓電鏡的樣品厚度要求較低）。掃瞄電子顯微鏡通用於觀察樣品表面結構。

電子顯微鏡的樣品通過和光學顯微鏡類似的方式製備，切片放於載網不是玻片。另有負染色法、噴鍍技術、冷凍斷裂復型、冷凍蝕刻。

間接成像技術主要通過掃瞄隧道顯微鏡、原子力顯微鏡、x射線衍射完成。掃瞄隧道顯微鏡具有高解析度、可測量樣品表面完整結構繪製三維圖、對操作條件要求低（可以在真空、常壓、空氣、液體中使用）對樣品表面沒有破壞作用、掃瞄速度快成像快、體積小等優點。缺點是要求樣品必須是導電體，限制了使用。

原子力顯微鏡解析度較stm的解析度低。x射線衍射是目前在原子水平上研究蛋白質、核酸和其他分子的唯一方式。

細胞化學技術

細胞化學技術包括酶細胞化學技術、免疫細胞化學技術、放射自顯影技術、示蹤細胞化學技術等。

酶細胞化學技術基本原理是酶反應和捕捉反應。關鍵點是能夠找到酶的特異性反應底物。捕捉反應是顯微鏡下可見的最終產物。

免疫細胞化學技術利用免疫反應定位組織或細胞中抗原成分分布的技術。主要包括免疫螢光技術和免疫電鏡技術。後者根據標記方法不同分為鐵蛋白技術、免疫酶標技術、免疫膠體金技術。

顯微分光光度技術用於分析樣品中細微結構中的化學成分，同時進行定位、定性和定量；顯微螢光光度術微觀而靈敏，研究細胞的結構、功能及其變化。核磁共振技術可以直接研究溶液和活細胞中的小分子質量（20kda以下）的蛋白質、核酸以及其他分子的結構，而不損傷細胞。

細胞分選技術

細胞分選技術主要利用流式細胞儀（flow cytometer, fcm）對細胞或者染色體進行分選，並對單個細胞或者其他生物微粒進行定量分析，可測量細胞的大小、形狀、細胞dna、rna含量和細胞總蛋白等。fcm主要由雷射光源、流室、訊號檢測器、訊號分析部件。需要用到探針。

細胞工程技術

細胞工程技術利用細胞生物學原理和方法、，結合工程學技術手段，有計畫改造細胞的技術。主要包括細胞及組織培養、細胞融合與單轉殖抗體技術、細胞生物反應器、染色體轉移、細胞器移植、轉基因移植。

細胞培養要注意營養、生存環境、廢物排出。環境因素主要之無菌環境、合適的溫度、一定的滲透壓和氣體環境。包括原代培養、傳代培養（細胞系和細胞株）。

植物組織培養經過脫分化和再分化的過程，通過激素誘導發育成植株。

細胞融合需要用到滅活的仙台病毒、聚乙二醇來誘導。單轉殖抗體技術需要篩選細胞。

顯微操作術可以對細胞進行解剖手術和微量注射。可用於細胞核移植、基因注入、染色體微切和胚胎切除手術。

分離技術

分離技術包括細胞組分的分離和生物大分子的分離。

離心分離技術包括速度離心和等密度離心。速度離心包括差速離心和移動區帶離心。移動區帶離心常用蔗糖密度梯度離心。

等密度離心根據被分離樣品的密度。顆粒的密度是影響最終位置的唯一因素，要求密度差異到達1%。

層析分離技術廣泛的用於蛋白質的分離。主要依據蛋白質的形態、大小和電荷的不同而設計的物理分析方法，都具有固定相和流動相。常用的是凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析。

分子生物學方法

分子生物學方法主要包括基因重組技術、基因轉移技術、分子雜交技術、pcr反應、序列分析等。基因工程技術包括：分、切、連、轉、選。

pcr過程：引物設計、dna模板的製備、pcr反應、產物的分離提純。

本章綜合對生物學研究技術做了介紹。

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