pcr雖然為乙個簡單的實驗，但在實際過程中可能會出現各種問題。產生問題的原因可能**於以下幾個方面：實驗操作，試劑質量，pcr反應過程中各種試劑的含量，以及反應條件，溫度設定等，本文對各個方面進行了討論，大家遇到問題後可以對號入座的查一下。
當然，具體問題的解決還依靠實驗者就可能的原因逐項排除，並不斷的摸索才能徹底解決。
假陰性，不出現擴增條帶
pcr反應的關鍵環節有①模板核酸的製備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及， ④pcr迴圈條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除淨，特別是染色體中的組蛋白，④在提取製備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。
在酶和引物***時，不出現擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配製有效而穩定的消化處理液，其程式亦應固定不宜隨意更改。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠。
引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是pcr失敗或擴增條帶不理想、容易瀰散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：
①選定乙個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看od值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做pcr有可能失敗，應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。
③引物應高濃度小量分裝儲存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。
mg2+濃度：mg2+離子濃度對pcr擴增效率影響很大，濃度過高可降低pcr擴增的特異性，濃度過低則影響pcr擴增產量甚至使pcr擴增失敗而不出擴增條帶。
反應體積的改變：通常進行pcr擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應用多大體積進行pcr擴增，是根據科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul 後，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對pcr擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低pcr擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是pcr失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其pcr擴增是不會成功的。
假陽性 出現的pcr擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行pcr擴增時，擴增出的pcr產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。
靶序列或擴增產物的交叉汙染：這種汙染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉汙染，導致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸汙染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。
可互相拼接，與引物互補後，可擴增出pcr產物，而導致假陽性的產生，可用巢式pcr方法來減輕或消除。
出現非特異性擴增帶
pcr擴增後出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。
二是mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及pcr迴圈次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些**的酶易出現非特異條帶而另一**的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：
必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一**的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少迴圈次數。
適當提高退火溫度或採用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。
出現片狀拖帶或塗抹帶
pcr擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量差，dntp濃度過高，mg2+濃度過高，退火溫度過低，迴圈次數過多引起。其對策有：
減少酶量，或調換另一**的酶。②減少dntp的濃度。適當降低mg2+濃度。
增加模板量，減少迴圈次數。
轉殖pcr產物
1)轉殖pcr產物的最優條件是什麼？
最佳插入片段：載體比需實驗確定。1：
1（插入片段：載體）常為最佳比，摩爾數比1：8或8：
1也行。應測定比值範圍。連線用5ul 2x連線液, 50ng質粒dna,1weiss單位的t4連線酶，插入片段共10ul。
室溫保溫1小時，或4℃過夜。在這2種溫度下，缺t-凸出端的載體會自連，產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數轉殖要求，為提高連線效率，需4℃過夜。
2)pcr產物是否需要用凝膠純化？
如凝膠分析擴增產物只有一條帶，不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶，可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高，這會產生高比例的帶有引物二聚體的轉殖，而非目的插入片段。
為此需在轉殖前做凝膠純化。
3)如果沒有**到目的片段，還需要作什麼對照實驗？
a）塗佈未轉化的感受態細胞。
如有菌落，表明氨苄失效，或汙染上帶有氨苄抗型的質粒，或產生氨苄抗型的菌落。
b）轉化完整質粒，計算菌落生長數，測定轉化效率。
例如，將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用於100ul感受態細胞轉化。用soc稀釋到1000ul後，用100ul鋪板。
培養過夜，產生1000個菌落。轉化率為： 產生菌落的總數/鋪板dna的總量。
鋪板dna的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng dna，用soc稀釋到1000u後含10 ng dna，用1/10鋪板，共用1 ng dna。轉化率為：
1000轉殖x10（3次方） ng /鋪板1 ng dna ug=10（6次方）cfu/ ug
轉化pgem-t應用10（8次方）cfu/ ug感受態細胞
如沒有菌落或少有菌落，感受態細胞的轉化率太低。
c）如用pgem-t正對照，或pcr產物，產生》20-40藍斑（用指定步驟10（8次方）cfu/ ug感受態細胞），表明載體失去t。可能是連線酶汙染了核酸酶。t4 dna連線酶（m1801，m1804，m1794）質量標準好無核酸酶汙染，不應用其它**的t4 dna連線酶替換。
d）用pgem-t或pgem-t easy載體，連線pgem-t正對照，轉化高頻率感受態細胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的實驗步驟，可得100個菌落，其中60%應為白斑，如產生》20-40藍斑, 沒有菌落或少有菌落，連線有問題。
4)對照實驗結果好，卻沒有**到目的片段，實驗出了什麼問題？
a）連線用室溫保溫1小時，能滿足大多數轉殖，為提高效率，需4℃過夜。
b）插入片段帶有汙染，使3`-t缺失，或抑制連線，抑制轉化。為此，將插入片段和pgem-t正對照混合，再連線。如降低了對照的菌落數，插入片段需純化，或重新製備。
如產生大量的藍斑，插入片段汙染有核酸酶，使pgem-t或pgem-t easy載體3`-t缺失。
c）插入片段不適於連線。用凝膠純化的插入片段，因受uv過度照射，時有發生。uv過度照射會產生嘧啶二聚體，不利於連線，dna必需重新純化。
d）帶有修復功能的耐熱dna聚合酶的擴增產物末端無a，後者是pgem-t或pgem-t easy載體轉殖所需。加taq dna聚合酶和核苷酸可在末端加a。詳情查pgem-t pgem-t easy載體技術資料（tm042）。
e）高度重複序列可能會不穩定，在擴增中產生缺失和重排，如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排，需用重組缺陷大腸桿菌菌株，如sure細胞
pcr反應體系與反應條件
標準的pcr反應體系：
10×擴增緩衝液 10ul
4種dntp混合物各200umol/l
引物各10～100pmol/l
模板dna0.1～2ug
taq dna聚合酶 2.5u
mg21.5mmol/l
加雙或三蒸水至 100ul
pcr反應五要素： 參加pcr反應的物質主要有五種即引物、酶、dntp、模板和mg2+
引物： 引物是pcr特異性反應的關鍵，pcr 產物的特異性取決於引物與模板dna互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板dna序列， 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用pcr就可將模板dna在體外大量擴增。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物鹼基：g+c含量以40-60%為宜，g+c太少擴增效果不佳，g+c過多易出現非特異條帶。atgc最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內部出現二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶。
⑤引物3'端的鹼基，特別是最末及倒數第二個鹼基，應嚴格要求配對，以避免因末端鹼基不配對而導致pcr失敗。
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