1 基本要求 [top]
1.1 掌握分光光度法基本原理—lambert-beer定律，能熟練運用lambert-beer公式進行有關計算。
1.1 掌握吸光度、透光率、吸光係數、摩爾吸光係數的概念。
1.1 熟悉標準曲線法及標準對照法。
1.1 了解物質對光的選擇性吸收及吸收光譜。
1.1 了解分光光度計的基本構造；提高測量靈敏度和準確度的方法。
1.1 了解紫外分光光度法進行物質定性分析和定量測定的基本原理。
2 重點難點 [top]
2.1 重點
分光光度法原理－lambert-beer定律。
2.2 難點
提高測量靈敏度和準確度的方法。
3 講授學時 [top]
建議3學時
4 內容提要 [top] 第一節第二節第三節第四節
4.1 第一節物質的吸收光譜
光照射某物質，物質能夠吸收光，使原有的基態轉為激發態，只有當分子的能量(h)與被照射物質粒子的基態和激發態能量之差(e)相等時才能被吸收。
m(基態)+ hm*(激發態)
也即物質對光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某波長的光而另一部分波長的光被透過，則溶液呈現透射光的顏色。
任一種溶液對不同波長的光吸收程度是不同的。以波長為橫座標，溶液對不同波長的光的吸收程度即吸光度a作縱座標得到的曲線，即為吸收光譜，或稱吸收曲線，吸收光譜中，吸光度最大處的波長為最大吸收波長，用max表示。一般而言，不同物質其吸收光譜的形狀及max均不同，它是定性鑑別物質的基礎；同一物質不同濃度的溶液，吸收光譜形狀相同，max不變，濃度愈大，峰值愈高，兩者成正比關係，這是進行定量分析的依據。
4.2 第二節分光光度法基本原理 [top]
當一束單色光照射溶液時，若不考慮反射，則入射光強度為io，吸收光強度為ia，透射光強度為it之間的關係為
io ═ ia + it13.1)
透射光的強度it與入射光強度io之比稱為透光率，用t表示
13.2)
透光率的負對數為吸光度a
13.3)
lambert和beer分別研究了光的吸收與溶液液層厚度及溶液的濃度之間的定量關係。得出著名的lambert- beer定律：溫度一定時，吸光度(a)與溶液濃度(c ), 液層厚度(b)成正比，即
a ═ bc13.4)
此即lambert- beer定律的數學表示式，式中b的單位為cm、c單位為moll-1，為摩爾吸光係數，單位為lmol -1cm-1。
若用質量濃度代替物質的量濃度c，則lambert-beer定律可表示為：
a ═ ab13.5)
式中的a稱為質量吸光係數，單位為lg -1cm-1。
a和可通過下式相互換算：
═ am13.6)
m表示被測物質的摩爾質量。
當入射光波長，溶劑種類，溶液溫度等因素確定時，和a只與物質的性質有關，是物質的特徵常數。
beer定律僅適用於單色光，即單一波長的光。
或a愈大，表明溶液對入射光愈容易吸收，測定的靈敏度愈高。
4.3 第三節可見分光光度法 [top]
（一）分光光度計
分光光度法所用的儀器稱為分光光度計。其主要部件由光源、單色光器、吸收池、檢測器。
（二）測定方法
在測定時，均首先繪製吸收光譜，然後確定max，以max作為入射光的波長。常用的測定方法有以下兩種：
1. 標準曲線法
取標準品配成一系列不同濃度的標準溶液，置於液層厚度相同的吸收池中，測定相應的吸光度a，以吸光度a為縱座標，溶液濃度c為橫座標，作出a對c的曲線圖。得一條通過座標原點的直線標準曲線。然後在相同條件下，測量被測溶液的吸光度，在標準曲線上即可查得與此吸光度相對應的溶液濃度。
2. 標準對照法
預先配製乙個與待測液濃度相接近的標準溶液(其濃度用cs表示)，測得其吸光度為as，再測定待測液的吸光度ax，則待測液濃度cs可從下式求得：
13.7)
4.4 第四節提高測量靈敏度和準確度的方法 [top]
（一） 分光光度法的誤差
1. 溶液偏離beer定律引起的誤差：表現為a-c曲線的線性較差，常出現彎曲。其主要原因一是吸光物質不穩定，發生偏離、締合等，二是單色光的純度差。
2. 儀器測定誤差：由於光電管的靈敏性差、光電流測量不准、光源不穩定等因素引起儀器測定誤差。
它使透光率很大，或很小時所產生的濃度的相對誤差均較大，故實際工作中，常控制透光率在20%-60%之間，即吸光度a在0.2-0.7之間。
3. 主觀誤差：由於操作不當引起的誤差稱為主觀誤差，應盡量避免或減少。
（二） 選擇適當的顯色劑
可見分光光度法只能測定有色溶液，對於無色溶液，必須加入顯色劑，使被測物質生成穩定的有色物質。顯色劑必須具備下列條件：①靈敏度高。
當顯色後的有色物質摩爾吸光系數值大於104時，可認為靈敏度較高。②選擇性好，盡可能選擇只與被測物顯色或被測所顯顏色與共存物所顯顏色有明顯差異。③生成的有色物質應有確定的組成。
④生成的有色物質應穩定。⑤顯色劑在測定波長處無明顯吸收。
（三） 選擇合適的測定條件
1. 波長的選擇
無干擾物質存在時，通常根據吸收光譜，選擇max為入射光的波長。
2. 顯色劑的用量
通常加入過量的顯色劑，一般通過實驗從a-c曲線來確定合適的用量。
3. 溶液的酸度
顯色劑多為有機弱酸，酸度改變直接影響顯色劑的平衡濃度，從而影響顯色反應的進行程度，恰當的酸度可通過實驗從a -ph曲線來確定。
4. 顯色時間和溫度
合適的時間和溫度也是通過實驗從a-t(時間)、a-t(溫度)曲線確定。
（四） 共存離子的干擾及其消除
為消除共存離子的干擾常通過控制顯色反應的酸度，或加入掩蔽劑，或預先通過離子交換等方法予以分離。
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