圖1 塗佈平板法
1.3 平板劃線法
最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，即用接種環以無菌操作沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行連續劃線（圖2），微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，並逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養後，可在平板表面得到單菌落。有時這種單菌落並非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反覆分離多次才可得到純種。其原理是將微生物樣品在固體培養基表面多次作「由點到線」稀釋而達到分離目的的。
劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。
圖2 平板劃線法
1.4 稀釋搖管法
用固體培養基分離嚴格厭氧菌有特殊性，如果該微生物暴露於空氣中不立即死亡，可以採用通常的方法製備平板，然後置放在封閉的容器中培養，容器中的氧氣可採用化學、物理或生物的方法清除。對於那些對氧氣更為敏感的厭氧性微生物，純培養的分離則可採用稀釋搖管培養法進行，它是稀釋倒平板法的一種變通形式。先將一系列盛無菌瓊脂培養基的試管加熱使瓊脂熔化後冷卻並保持在50℃左右，將待分離的材料用這些試管進行梯度稀釋，試管迅速搖動均勻，冷凝後，在瓊脂柱表面傾倒一層滅菌液體石蠟和固體石蠟的混合物，將培養基和空氣隔開。
培養後，菌落形成在瓊脂柱的中間。進行單菌落的挑取和移植，需先用乙隻滅菌針將液體石蠟--石蠟蓋取出，再用乙隻毛細管插入瓊脂和管壁之間，吹入無菌無氧氣體，將瓊脂柱吸出，置放在培養皿中，用無菌刀將瓊脂柱切成薄片進行觀察和菌落的移植。
2、用液體培養基分離和純化
大多數細菌和真菌，用平板法分離通常是滿意的，因為它們的大多數種類在固體培養基上長得很好。然而迄今為止並不是所有的微生物都能在固體培養基上生長，例如一些細胞大的細菌、許多原生動物和藻類等，這些微生物仍需要用液體培養基分離來獲得純培養。
稀釋法是液體培養基分離純化常用的方法。接種物在液體培養基中進行順序稀釋，以得到高度稀釋的效果，使一支試管中分配不到乙個微生物。如果經稀釋後的大多數試管中沒有微生物生長，那麼有微生物生長的試管得到的培養物可能就是純培養物。
如果經稀釋後的試管中有微生物生長的比例提高了，得到純培養物的機率就會急劇下降。因此，採用稀釋法進行液體分離，必須在同乙個稀釋度的許多平行試管中，大多數（一般應超過95%）表現為不生長。
3、單細胞（孢子）分離
只能分離出混雜微生物群體中佔數量優勢的種類是稀釋法的乙個重要缺點。在自然界，很多微生物在混雜群體中都是少數。這時，可以採取顯微分離法從混雜群體中直接分離單個細胞或單個個體進行培養以獲得純培養，稱為單細胞（或單孢子）分離法。
單細胞分離法的難度與細胞或個體的大小成反比，較大的微生物如藻類、原生動物較容易，個體很小的細菌則較難。
較大的微生物，可採用毛細管提取單個個體，並在大量的滅菌培養基中轉移清洗幾次，除去較小微生物的汙染。這項操作可在低倍顯微鏡，如解剖顯微鏡下進行。對於個體相對較小的微生物，需採用顯微操作儀，在顯微鏡下用毛細管或顯微針、鉤、環等挑取單個微生物細胞或孢子以獲得純培養。
在沒有顯微操作儀時，也可採用一些變通的方法在顯微鏡下進行單細胞分離，例如將經適當稀釋後的樣品製備成小液滴在顯微鏡下觀察，選取只含乙個細胞的液體來進行純培養物的分離。單細胞分離法對操作技術有比較高的要求，多限於高度專業化的科學研究中採用。
4、選擇培養分離
沒有一種培養基或一種培養條件能夠滿足一切微生物生長的需要，在一定程度上所有的培養基都是選擇性的。如果某種微生物的生長需要是已知的，也可以設計特定環境使之適合這種微生物的生長，因而能夠從混雜的微生物群體中把這種微生物選擇培養出來，儘管在混雜的微生物群體中這種微生物可能只佔少數。這種通過選擇培養進行微生物純培養分離的技術稱為選擇培養分離，特別適用於從自然界中分離、尋找有用的微生物。
自然界中，在大多數場合微生物群落是由多種微生物組成的，從中分離出所需的特定微生物是十分困難的，尤其當某一種微生物所存在的數量與其它微生物相比非常少時，單採用一般的平板稀釋法幾乎是不可能的。要分離這種微生物，必須根據該微生物的特點，包括營養、生理、生長條件等，採用選擇培養分離的方法。或抑制使大多數微生物不能生長，或造成有利於該菌生長的環境，經過一定時間培養後使該菌在群落中的數量上公升，再通過平板稀釋等方法對它進行純培養分離。
4.1 利用選擇平板進行直接分離
根據待分離微生物的特點擊擇不同的培養條件，有多種方法可以採用。例如要分離高溫菌，可在高溫條件下進行培養；要分離某種抗菌素抗性菌株，可在加有抗菌素的平板上進行分離；有些微生物如螺旋體、粘細菌、藍細菌等能在瓊脂平板表面或裡面滑行，可以利用它們的滑動特點進行分離純化，因為滑行能使它們自己和其它不能移動的微生物分開。可將微生物群落點種到平板上，讓微生物滑行，從滑行前沿挑取接種物接種，反覆進行，得到純培養物。
4.2 富集培養
富集培養法原理和方法非常簡單，利用不同微生物間生命活動特點的不同，制定特定的環境條件，使僅適應於該條件的微生物旺盛生長，從而使其在群落中的數量大大增加，很容易地分離到所需的特定微生物。富集條件可根據所需分離的微生物的特點從物理、化學、生物、及綜合多個方面進行選擇，如溫度、ph、紫外線、高壓、光照、氧氣、營養等等許多方面。在相同的培養基和培養條件下，經過多次重複移種，最後富集的菌株很容易在固體培養基上長出單菌落。
如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應敏感宿主細胞群體中，使其大量生長。通過多次重複移種便可以得到純的寄生菌。
5、二元培養物
分離的目的通常是要得到純培養。然而，在有些情況下這是很難做到的。但可用二元培養物作為純化培養的替代物。
含有二種以上微生物的培養物稱為混合培養物，而如果培養物中只含有二種微生物，而且是有意識的保持二者之間的特定關係的培養物稱為二元培養物。例如二元培養物是儲存病毒的最有效途徑，因為病毒是細胞生物的嚴格的細胞內寄生物。有一些具有細胞的微生物也是嚴格的其它生物的細胞內寄生物，或特殊的共生關係。
對於這些生物，二元培養物是在實驗室控制條件下可能達到的最接近於純培養的培養方法。另外，獵食細小微生物的原生動物也很容易用二元培養法在實驗室培養，培養物由原生動物和它獵食的微生物二者組成。例如，纖毛蟲、變形蟲和粘菌。
在以上介紹的幾種方法中，平板分離法普遍用於實驗室微生物的分離與純化。微生物在固體培養基上生長形成的單個菌落，通常是由乙個細胞繁殖而成的集合體。因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養。
獲取單個菌落的方法可通過稀釋塗佈平板或平板劃線等技術完成。值得指出的是，從微生物群體中經分離生長在平板上的單個菌落並不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀察其菌落特徵外，還要結合顯微鏡檢測個體形態特徵後才能確定，有些微生物的純培養要經過一系列分離與純化過程和多種特徵鑑定才能得到。
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