一、材料
1 細胞培養試劑
2 慢病毒包裝試劑
3 耗材
● 50 ml離心管
● 15 ml離心管
● 10 cm細胞培養皿
● 0.45μm過濾器
● 2 ml ep管
二、操作流程
1 細胞培養
1.1 293t/293ft細胞的復甦
1) 將完全培養液從4°c中取出放置到室溫預熱30 min左右。在超淨台內，用吸管吸取6~7ml完全培養液至15 ml離心管中；
2) 快速將凍存的細胞從液氮中取出，並迅速用鑷子夾住蓋子放入37°c 水浴中快速晃動（水不要沒到蓋子），使其在1~2分鐘內完全融化；
3) 在超淨台內，用酒精棉球擦拭凍存管外壁消毒，用吸管吸取所有融化的細胞懸液至裝準備好的完全培養液中，輕輕吹打混勻，使凍存液分散開（目的是讓dmso分散，降低恢復室溫的dmso對細胞造成的毒性作用）。
4) 在室溫條件下，250 g離心4分鐘。
5) 離心後，在超淨台內小心倒去上清，用吸管吸取 2 ml新鮮完全培養液重懸細胞至單細胞懸液，再轉移已經加好培養基的培養瓶/培養皿中，寫上細胞名稱、日期，放置 37°c、5% co2飽和濕度培養箱內培養。（首次復甦細胞時，離心重懸後需取樣計數，根據細胞數選擇面積合適的培養容器。）
6) 復甦翌日，給復甦的293t細胞更換新鮮的完全培養基。
1.2 293t/293ft細胞傳代
1) 待細胞長至60%-70%融合度即可傳代。將培養瓶裡的所有培養液全部移去，用1×pbs洗滌細胞兩次（洗滌速度要快，避免細胞乾涸時間過長），以去除殘餘的培養液和血清（血清含有胰酶的抑制因子）；
2) 加入適當的胰酶溶液，能使其完全浸過細胞即可，室溫孵育1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，可看到大部分細胞變圓不貼壁，拍打培養瓶兩側會有大量細胞脫離，此時應立即終止消化，若細胞仍然有大部分貼壁，可適當延長孵育時間；
3) 加入等體積完全培養液終止消化，並用吸管吹打培養瓶底2-3次使所有細胞徹底脫壁。用吸管轉移細胞懸浮液到15 ml 離心管中，用吸管吸取2-3 ml的pbs將殘餘細胞沖洗下來，一併加到15ml離心管中，混勻吹打10次使細胞分散；
4) 在室溫條件下，250g離心4分鐘。離心後，倒去上清，用2 ml完全培養液重懸細胞，取樣計數；
5) 根據計數結果，按照 2×104～5×104/cm2的細胞密度接種細胞；寫上細胞名稱、日期，放置37°c、 5% co2飽和濕度培養箱內培養。
注1：t75培養瓶建議293ft細胞接種1.8×106；293t 接種2.0×106細胞量。
注2：293t細胞生長達70%-80%融合度即可傳代；293ft細胞生長達到60%融合度即可傳代，不可生長過密；
1.3 293t/293ft細胞凍存
1) 待細胞長至 70%-80%融合度即可傳代。消化過程可參照1.2相關步驟。
2) 消化後，取樣待計數。計數同時，將細胞於室溫條件下，250g離心4分鐘。
3) 離心後，倒去上清（上清需吸取乾淨），根據計數結果，按1.5-2×106細胞量/ml的密度，用凍存液進行重懸，並將懸液平均分至事先做好標示的凍存管中，旋緊蓋子，按所使用的凍存儀器操作步驟進行凍存。
注：凍存管標示內容包括：細胞名稱，細胞代次，以及凍存批號（批號標示：時間+人員**+批次流水號）。
2 慢病毒包裝
2.1 慢病毒包裝前的準備工作
1) 包裝培養皿的處理
病毒包裝前的細胞需要接種在有明膠包被的培養皿上。接種細胞前，吸取0.1%明膠加至培養皿中，能完全覆蓋表面即可，室溫靜置包被30分鐘。30分鐘後吸走明膠，使其晾乾液體即可。
2) 準備293ft/293t細胞。
細胞的生長狀態影響病毒的生產。應使用復甦後傳代培養至少兩代的細胞包裝慢病毒，但不能使用超過10代的細胞。將細胞傳到包被了明膠的直徑10 cm培養皿中。
2.2 慢病毒包裝過程（脂質體轉染法）
1） 轉染前一天，接種293t細胞到乙個直徑10 cm培養皿中，接種細胞數量應以轉染當天的細胞生長達到90%~95%融合為佳（乙個直徑10 cm培養皿，如在上午接種4.8×106個細胞，下午接種5.0×106個細胞為宜；加10 ml含丙酮酸鈉的血清培養基）；
2） 轉染當天，觀察細胞能否包裝病毒。主要觀察的指標是：細胞是否接種均勻，細胞的融合程度是否達到 90%~95%。
若細胞的狀態合適，則從細胞中去除培養液，加入5 ml病毒包裝用培養液，為了避免細胞脫壁，培養液應沿培養皿壁緩慢加入。
注：包裝培養基不能含有抗生素，而且在每次使用前，培養基應37°c、5% co2培養箱中平衡ph值。
3） 準備 dna-lipofectamine2000複合物，以乙個直徑10 cm培養皿的用量為示範：
a. 準備一支無菌的5 ml離心管加入1.5 ml無血清opti-mem培養液、輔助質粒和慢病毒表達質粒，充分顛倒混勻；
注： 表達質粒用量(μg) =質粒大小(kb)×1.27；無血清opti-mem培養液需預熱至37°c。
b. 準備另外一支無菌的5 ml離心管裡，加入1.5 ml無血清opti-mem培養液和68μl的lipofectamine2000，輕輕顛倒混勻，室溫孵育30分鐘；
c. 30分鐘後，把含有質粒dna的無血清opti-mem培養液加入到含lipofectamine2000的無血清opti-mem培養液，輕輕顛倒混勻，室溫孵育 30 分鐘；
d. 30分鐘後，dna- lipofectamine2000 複合物形成；溶液有可能變混濁，但是不會影響轉染效果。
4） 把 dna- lipofectamine2000 複合物一滴一滴地新增到293t細胞中，輕輕地前後搖晃培養皿以混勻複合物。放置 37°c、5% co2 飽和濕度培養箱中培養。轉染後的 4-6 小時內每隔 30 分鐘需觀察細胞毒性反應，當出現可觀察的毒性反應時，應立即吸除原培養液，加入8 ml病毒包裝用培養液，放置 37°c、5% co2 飽和濕度培養箱中繼續培養。
2.3 慢病毒收集和濃縮（peg濃縮法）
1) 轉染後48小時，收集含有病毒的培養液。把培養液吸到一支無菌的有蓋 50 ml 離心管中，再補加8 ml 病毒包裝用培養液至還能產毒的細胞中；
2) 4°c、3000 rpm離心15分鐘，低速離心病毒上清，去除細胞碎片，**上清；
3) 轉染後 72 小時，收集含有病毒的培養液。4°c、3000 rpm離心15分鐘，低速離心病毒上清，去除細胞碎片，**上清。將48小時收集的病毒上清液和72小時收集的病毒上清液，用0.
45μm的小濾器過濾，用50 ml離心管收集濾液；
4) 根據濾液體積加入對應量的50% peg6000和40 mm nacl溶液。充分均勻混合液，靜置於4°c沉澱過夜（x ml病毒濾液加入0.2073x ml的50% peg6000和0.
012195x ml的40 mm nacl）。
5) 次日取出濃縮管，4°c、1500g離心30分鐘後倒掉上清，再進行4°c、1500g緩慢加速，減速離心4分鐘；
6) 用移液槍吸除多餘上清，按照100 μl hbss溶解乙個10cm皿產毒量的比例，用適當的hbss體積，使用合適的槍頭緩慢而充分地吹打沉澱至單個病毒懸液；
7) 按照每管100 μl病毒液分裝到0.5 ml凍存管中（分裝前，應將標有病毒名稱、批號的標籤貼在凍存管外壁），放置-80°c儲存；填寫病毒入庫記錄。
慢病毒包裝操作說明
注意 xfect polymer 不要在室溫下擱置長於30min 4.充分混均每個管 5.把tube2新增到tube1中，中速渦旋10秒。6.在室混下孵育dna xfect混合物10min，這時可形成奈米複合物。7.把1200l的dna xfect溶液 第5步製備 加入到第1步準備好的細胞中，前後左...
包裝操作規範
一 一般貨物包裝規範 1 客戶交運的貨物提供紙箱外包裝。1 規定紙箱包裝後的長度不得小於25厘公尺，寬度不得小於15厘公尺，高度不得小於10厘公尺，若不符合以上要求，則須另加符合要求的紙箱外包裝。2 每件貨物的紙箱邊 角 封口等處必須全部封閉，以防止貨物在裝卸運輸過程中掉漏而導致貨物遺失或偷盜 若未...
包裝操作說明
包裝前準備 1.仔細檢驗待包裝產品，保證產品無髒汙 並貼有銘牌和生產編號後方可開始包裝。2.仔細檢驗包裝盒，保證包裝盒無破損 壓痕 劃傷後方可開始包裝。3.檢驗電池 usb插頭和產品是否裝袋 usb線和導聯線是否已纏綁絲。包裝過程和步驟 1.把包裝盒內底的海綿更換成夾層 如圖所示 2.放上底托棉 如...