作者：葉惠芬劉朝暉周小棉陳惠玲趙祝香
【摘要】 目的研究肺炎克雷伯菌對亞胺培南的耐藥機制。方法採用濃度梯度法(etest)測定細菌對各種抗菌藥物最低抑菌濃度，聚合酶鏈反應(pcr)擴增β 內醯胺酶基因，並對擴增產物進行基因測序，用十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds page)進行外膜蛋白(omp)分析。用抑制試驗進行主動外排機制檢測。
結果 4株菌株全部攜帶有shv 12型和dha 1型超廣譜β 內醯胺酶(esbls)基因，3株攜帶ctx m 14型esbls基因；4株菌外膜蛋白分析發現，肺炎克雷伯菌亞胺培南耐藥株與敏感株相比，缺少分子量在32500～47500之間的一條帶，從位置判斷該條帶可能為omp 36000或omp 37000的一種外膜蛋白；主動外排檢測全部為陰性。結論同時產多種β 內醯胺酶合併外膜蛋白缺失可能是導致本組肺炎克雷伯菌對亞胺培南耐藥的原因。
【關鍵詞】 肺炎克雷伯菌； β 內醯胺酶； 外膜蛋白
肺炎克雷伯菌為臨床感染常見病原菌之一，可引起肺炎、尿路感染、敗血症、傷口感染、腦膜炎等多種疾病。隨著多重耐藥菌株的日漸增多， **該菌引起的感染變得越來越困難［1，2］。亞胺培南是碳青黴烯類抗生素，其對革蘭陰性菌產生的超廣譜β 內醯胺酶及ampc酶都很穩定，因此臨床上亞胺培南一直是**革蘭陰性菌感染的有效藥物。
近年來，由於亞胺培南的廣泛使用，國內外均發現對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌，給**帶來諸多困難。對亞胺培南耐藥機制的研究以及如何減少其耐藥株的產生，已成為當前該領域最為關注的焦點。我們對近年來在臨床上分離的4株對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌進行研究，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 菌株**
收集我院住院感染患者送檢痰樣本中分離的亞胺培南耐藥肺炎克雷伯菌4株，其中從呼吸科和icu病房分離各1株，神經科1株，幹部病房1株，全部按照《全國臨床檢驗操作規程》第二版常規培養分離；菌株採用bio merieux公司的vitek2全自動鑑定系統鑑定。
1.2 藥敏試驗
採用etest法測定最低抑菌濃度(mic)，全部操作與結果判斷均嚴格按照2023年美國臨床實驗室標準化研究所(clsi)標準進行。質控菌株為大腸埃希菌atcc25922和產酶型大腸埃希菌atcc35218。
1.3 esbls和ampc酶檢測
採用酶提取物三維試驗方法，按照文獻 ［3］操作，。試驗所用藥敏紙片和瓊脂均為英國oxoid公司產品。
1.4 細菌dna的提取
將平皿上過夜培養的受試菌落接種於5ml lb肉湯中，37℃振盪培養12～16h後，13000r/min離心1min收集沉澱(菌體)；採用賽百盛(sbs genetech)的矽膠膜型質粒dna小量提取試劑盒提取細菌質粒。
1.5 pcr擴增及序列分析
1.6 外膜蛋白(omp)分析
參考文獻［6］方法並改進，將肺炎克雷伯菌接種於5ml lb培養液，置37℃恆溫搖床孵育過夜，將菌液加入200ml lb液體培養基37℃恆溫搖床繼續培養5h後將培養物以4000r/min，4℃離心10min，棄上清，沉澱用50mmol/l ph7.0磷酸鹽緩衝液(pbs)洗滌3次，懸浮於10mmol/l tris hcl(ph7.4)，冰浴條件下超聲破碎細菌，每次2s，間隔3s，共40個迴圈，將破碎菌液用4000r/min，4℃離心30min，以除去未破碎細菌，取上清液25000r/min 4℃離心30min，棄上清，沉澱即為外膜蛋白，沉澱細菌膜用緩衝液重新懸浮，並在樣品中加苯甲基磺醯氨(pmsf)。
外膜蛋白在電泳之前100℃加熱5min，使蛋白質變性，十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(sds page)分離外膜蛋白，凝膠濃度12.0%，每點樣糟加10μl樣品，電壓40v，當染料前沿進入分離膠以後，提高電壓到100v，繼續電泳，直至溴酚藍染料到達分離膠底部，電泳後用考馬斯亮藍r250染色30min，脫色過夜。
1.7 主動外排機制檢測
參考文獻［7］方法進行，配製2種mh平板，1種加入20μg/ml的利舍平，另1種不加利舍平，以觀察利舍平對肺炎克雷伯菌是否有抑制作用。上述平板均塗佈含1.5×108cfu/ml的菌液，然後貼上亞胺培南etest試條。
含利舍平組mic為不含利舍平組的1/3或更低，抑制試驗陽性，提示主動外排存在。
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