1、方法操作不難，最大的難處是出現異常結果時如何解決？這就需要掌握免疫組化實驗原理，每一步知道為什麼這樣做，這樣你才敢大膽地改革先前的不對的方法步驟。如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間，這三者一般是相互成反比的（相對），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度、時間決定反應的量。
就拿溫度來說，可以有4度、室溫、37度，我推薦4度最佳，反應最溫和，背景較淺；而37度反應速度較快，時間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環境溫度控制在一定的範圍，否則，盡量選擇前兩者。
2、免疫組化最大的優勢是定位和定性。相比於其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定性靈敏度高、定位較直接準確，是定位檢測分析首選方法。尤其對於有些因子的轉位研究十分有用。
3、免疫組化結果定量分析的前提是高質量的染色切片。免疫組化結果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準確，這種原則可能也是我們日常審稿時判定研究結果的必備條件。
4、免疫組化實驗一定要設定陽性對照和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；陰性對照一般是用pbs或非一抗替代一抗來進行反應，其餘步驟均一致。前者是排除方法和實驗系統有無問題；後者是排除有無一抗外的非特異性染色。
5、免疫組化的應用廣泛，是當前實驗研究的最重要方法之一。如今發sci**時，明顯感覺僅靠量化的資料來發文章很難，加一些形態學資料或**，老外十分歡迎，可能是怕你學術造假吧。當然也不能做假陽性或假陰性結果。
6、免疫組化技術掌握與否的鑑定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。我在平時帶教中就發現許多研究生把我已經摸索很成熟的反應條件、濃度、方法步驟，重複運用於同一性質的切片和同一種抗體，做出來後就覺得自己已經掌握了免疫組化方法，更換一種抗體後，居然連二抗的種屬**都拿錯了。失敗往往促進你去思考試驗原理和過程，成功有時也加快你自傲。
7、實驗方法需要動手+動腦。如今我還不敢說我在免疫組化什麼都知道。我只所以今天敢在這裡說這說那，這是因為我經過了反覆的動手+動腦，把理論原理運用於實踐，在把實踐中發現的問題帶到理論知識中去解決，最終把理論與實踐融會貫通。
一、概念和常用方法介紹
1、定義用標記的特異性抗體對組織切片或細胞標本中某些化學成分的分布和含量進行組織和細胞原位定性、定位或定量研究，這種技術稱為免疫組織化學（immunohistochemistry）技術或免疫細胞化學（immunocytochemistry）技術。
2、原理根據抗原抗體反應和化學顯色原理，組織切片或細胞標本中的抗原先和一抗結合，再利用一抗與標記生物素、螢光素等的二抗進行反應，前者再用標記辣根過氧化物酶（hrp）或鹼性磷酸酶（akp）等的抗生物素（如鏈黴親和素等）結合，最後通過呈色反應或螢光來顯示細胞或組織中化學成分，在光學顯微鏡或螢光顯微鏡下可清晰看見細胞內發生的抗原抗體反應產物，從而能夠在細胞爬片或組織切片上原位確定某些化學成分的分布和含量。
3、分類 1）按標記物質的種類，如螢光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根過氧化物酶和鹼性磷酸酶）、鐵蛋白、膠體金等，可分為免疫螢光法、放射免疫法、免疫酶標法和免疫金銀法等。2）按染色步驟可分為直接法（又稱一步法）和間接法（二步、三步或多步法）。與直接法相比，間接法的靈敏度提高了許多。
3）按結合方式可分為抗原-抗體結合，如過氧化物酶-抗過氧化物酶（pap）法；親和連線，如卵白素-生物素-過氧化物酶複合物（abc）法、鏈黴菌抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈結（sp）法等，其中sp法是比較常用的方法；聚合物鏈結，如即用型二步法，此方法尤其適合於內源性生物素含量高的組織抗原檢測。
4、目前幾種常用免疫組化方法簡單介紹 1）免疫螢光方法是最早建立的免疫組織化學技術。它利用抗原抗體特異性結合的原理，先將已知抗體標上螢光素，以此作為探針檢查細胞或組織內的相應抗原，在螢光顯微鏡下觀察。當抗原抗體複合物中的螢光素受激發光的照射後即會發出一定波長的螢光，從而可確定組織中某種抗原的定位，進而還可進行定量分析。
由於免疫螢光技術特異性強、靈敏度高、快速簡便，所以在臨床病理診斷、檢驗中應用較廣。
2）免疫酶標方法免疫酶標方法是繼免疫螢光後，於60年代發展起來的技術。基本原理是先以酶標記的抗體與組織或細胞作用，然後加入酶的底物，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，通過光鏡或電鏡，對細胞表面和細胞內的各種抗原成分進行定位研究。免疫酶標技術是目前最常用的技術。
本方法與免疫螢光技術相比的主要優點是：定位準確，對比度好，染色標本可長期儲存，適合於光、電鏡研究等。免疫酶標方法的發展非常迅速，已經衍生出了多種標記方法，且隨著方法的不斷改進和創新，其特異性和靈敏度都在不斷提高，使用也越來越方便。
目前在病理診斷中廣為使用的有abc法、sp三步法、即用型二步法檢測系統等。
3）免疫膠體金技術免疫膠體金技術是以膠體金這樣一種特殊的金屬顆粒作為標記物。膠體金是指金的水溶膠，它能迅速而穩定地吸附蛋白，對蛋白的生物學活性則沒有明顯的影響。因此，用膠體金標記一抗、二抗或其他能特異性結合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌a蛋白)等作為探針，就能對組織或細胞內的抗原進行定性、定位，甚至定量研究。
由於膠體金有不同大小的顆粒，且膠體金的電子密度高，所以免疫膠體金技術特別適合於免疫電鏡的單標記或多標記定位研究。由於膠體金本身呈淡至深紅色，因此也適合進行光鏡觀察。如應用銀加強的免疫金銀法則更便於光鏡觀察。
5、被檢測的物質組織或細胞中凡是能作為抗原或半抗原，如蛋白質、多肽、氨基酸、多醣、磷脂、受體、酶、激素、核酸及病原體等都可用相應的特異性抗體進行檢測。
6、特點 1）特異性強。免疫學的基本原理決定抗原與抗體之間的結合具有高度特異性，因此，免疫組化從理論上講也是組織細胞中抗原的特定顯示，如角蛋白（keratin）顯示上皮成分，lca顯示淋巴細胞成分。只有當組織細胞中存在交叉抗原時，才會出現交叉反應。
2）敏感性高。在應用免疫組化的起始階段，由於技術上的限制，只有直接法、間接法等敏感性不高的技術，那時的抗體只能稀釋幾倍、幾十倍；現在由於abc法或sp三步法的出現，使抗體稀釋上千倍、上萬倍甚至上億倍仍可在組織細胞中與抗原結合，這樣高敏感性的抗體抗原反應，使免疫組化方法越來越方便地應用於常規病理診斷工作。3）定位準確、形態與功能相結合。
該技術通過抗原抗體反應及呈色反應，可在組織和細胞中進行抗原的準確定位，因而可同時對不同抗原在同一組織或細胞中進行定位觀察，這樣就可以進行形態與功能相結合的研究，對病理學領域開展深入研究是十分有意義的。
7、從蛋白水平檢測角度，免疫組化技術與western blotting、elisa的異同1）western blotting：蛋白質免疫印跡，也是利用抗體抗原反應原理，結合化學發光等技術來檢查組織或細胞樣品內蛋白含量的檢測方法。與免疫組化技術相比，定量可能更加準確；當然western blotting也可定性和定位（通過提取膜蛋白或核蛋白、胞漿蛋白分別檢測其中抗原含量，進而間接反映它們的定位），但敏感性遠遠低於免疫組化技術。
2）elisa：酶聯免疫吸附試驗，也是利用抗體-抗原-抗原結合反應原理來檢查體液或組織勻漿中蛋白含量的檢測。與免疫組化技術相比，定量最準確，是分泌性蛋白檢測首選方法之一。
二、實驗流程簡介
1、sp三步法1）石蠟切片，常規脫蠟至水。2）0.3%或3%h2o2去離子水（無色液體）孵育10-30分鐘，以滅活內源性過氧化物
酶活性。3）蒸餾水沖洗，pbs浸泡5分鐘4）候選步驟：採用抗原修復：
微波（建議30分鐘內4次中火）、高壓、酶修復方法。自然冷卻，再用3分鐘×3次. 5）血清封閉：
室溫15-30分鐘，盡可能與二抗**一致。傾去，勿洗。 6）滴加適當比例稀釋的一抗，37℃孵育2~3小時或4℃過夜（最好復溫）。
pbs沖洗，3分鐘×5次。7）滴加生物素標記的二抗，室溫或37℃孵育30分鐘-1h。8）pbs沖洗，3分鐘×5次。
9）滴加sp（鏈黴親和素-過氧化物酶），室溫或37℃孵育30分鐘-1h。10）pbs沖洗，3分鐘×5次。11）顯色劑顯色（dab等）。
12）自來水充分沖洗。13）可進行復染，脫水，透明。14）選擇適當的封片劑封片。
2、即用型二步法 1）脫蠟、水化組織切片。2）根據所應用的一抗的特殊要求，對組織切片進行預處理。3）0.
3%或3%h2o2去離子水孵育5分鐘-30分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶，pbs或tbs沖洗。4）滴加一抗，室溫或37℃孵育30~60分鐘，或4℃過夜，pbs或tbs浸洗3分鐘×5次。5）滴加enhangcer增強劑，37度30min，pbs或tbs浸洗3分鐘×5次。
6）滴加通用型igg抗體-fab段-hrp多聚體，室溫/37℃孵育30分鐘-1h，pbs/tbs沖洗，3分鐘×5次。7）應用dab溶液顯色。8）蒸餾水沖洗、復染、脫水、透明、封片。
三、免疫螢光技術
1、免疫螢光方法中的重要環節 1）冰凍切片製備：建議用新鮮組織，否則組織細胞內部結構破壞，易使抗原瀰散。選用乾淨鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等，防止裂片和脫片嚴重。
2）組織切片固定：切好片風乾後立即用冰西奈山環保組織固定液固定5-10min，尤其要較長時間儲存的白片，一定要及時固定和適當儲存。3）血清封閉：
為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合，需要在一抗孵育前先用血清（與二抗**一致）封閉，減弱背景著色。血清封閉的時間是可以調整的，一般10-30min。4）一抗孵育條件：
在免疫組化反應中最重要，包括孵育時間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種：4度、室溫、37度，其中4度效果最佳；孵育時間：
這與溫度、抗體濃度有關，一般37度1-2h，而4度過夜和從冰箱拿出後37度復溫45min。具體條件還要摸索。5）二抗孵育條件：
二抗一般室溫或37度30min-1h，具體時間需要摸索，而濃度一般有工作液，若是濃縮液還要摸索濃度，切記要避光反應。但在免疫螢光中我們一般先把二抗濃度和孵育時間先定下，然後去摸索一抗濃度和孵育時間。最後，螢光素標記的二抗隨著儲存時間的延長，可能後有大量的游離螢光素殘留，需要注意配製時小包裝和並進行適當的離心。
6）復染：目的是形成細胞輪廓，從而更好地對目標蛋白進行定位。一般常用dapi復染。
7）封片：為了長期儲存，我們一般用緩衝甘油等封片，此外還有專門的抗螢光萃滅封片液。避免產生氣泡，方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液，然後一手拿住蓋片某一拐角，而另一手拿對面的那個拐角，接近封片液近端的拐角先降低，直至接觸到液體時為止；當發現液體接觸面在不斷瀰散時，則可以緩慢降低另一拐角，這樣一般不會產生氣泡。
8）切片清洗：為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色，所以適當地加強清洗（延長時間和增多次數）尤為重要，我一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育後的清洗均為5次*5min。注意（1）單獨沖洗，防止交叉反應造成汙染。
（2）溫柔沖洗，防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式；（3）沖洗的時間要足夠，才能徹底洗去結合的物質。（4）pbs的ph和離子強度的使用和要求。
這方面我有慘痛教訓，當時我買的抗體稀釋液偏酸，結果背景一片黃（未見特異性染色），建議ph在7.4-7.6濃度是0.
01m。（中性及弱礆性條件（ph7-8）有利於免疫複合物的形成，而酸性條件則有利於分解；低離子強度有利於免疫複合物的形成，而高離子強度則有利於分解） 9）拍照：有條件的話最好立即拍照，若不能及時拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和濕度。
使用螢光顯微鏡注意嚴格按照螢光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程式；應在暗室中進行檢查；防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡；檢查時間每次以1~2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，螢光減弱；標本受紫外線照射3~5min後，螢光也明顯減弱或褪色；激發光長時間的照射，會發生螢光的衰減和淬滅現象；所以最多不得超過2~3h；螢光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅後欲再啟用時，須待燈光充分冷卻後才能點燃。
一天中應避免數次點燃光源。關閉汞燈至少在開啟15-30分鐘後；標本染色後立即觀察，因時間久了螢光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑膠袋中4℃儲存，可延緩螢光減弱時間，防止封裱劑蒸發；使用的玻片等載體，都必須厚度均勻，無明顯的自發螢光，如果使用油鏡，還必須保證鏡油為無螢光鏡油；電源最好裝穩壓器，否則電壓不穩不僅會降低汞燈的壽命，也會影響鏡檢的效果。
免疫組化相關知識
免疫組化，是應用免疫學基本原理 抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 螢光素 酶 金屬離子 同位素 顯色來確定組織細胞內抗原 多肽和蛋白質 對其進行定位 定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術 immunohistochemistry 或免疫細胞化學技術 imm...
免疫組化實驗報告
二 石蠟包埋的注意事項 1 取材和固定 根據客戶要求將切取3mm大小的組織塊。2 脫水和透明 3 浸蠟和包埋 浸蠟 將透明的組織放入蠟杯 蠟杯 蠟杯 一般總的浸蠟時間為 小時左右。4 包埋 1 組織浸入石蠟後，包埋前將組織移入包埋用石蠟杯內。從恆溫箱取出置於三角架上，其下點燃酒精燈，以保持石蠟的溶解...
免疫組化試劑的正確使用
免疫組化試劑的選擇 一抗的正確選擇與使用 1.首菜單轉殖抗體 單轉殖抗體具有高特異性 高親和力 交叉反應少等特點，避免與細胞或組織蛋白的非特異性結合，減少染色背景。2.多轉殖抗體 最好是經樣本 種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉液 可以是bsa或二抗 的正常動物血清 ...