免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（螢光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。
免疫組織化學簡介
免疫組織化學又稱免疫細胞化學，是指帶顯色劑標記的特異性抗體在組織細胞原位通過抗原抗體反應和組織化學的呈色反應，對相應炕原進行定性、定位、定量測定的一項新技術。它把免疫反應的特異性、組織化學的可見性巧妙地結合起來，借助顯微鏡(包括螢光顯微鏡、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細胞、亞細胞水平檢測各種抗原物質(如蛋白質、多肽、酶、激素、病原體以及受體等)。
免疫組化技術的基本原理
免疫組化技術是一種綜合定性、定位和定量；形態、機能和代謝密切結合為一體的研究和檢測技術。在原位檢測出病原的同時，還能觀察到組織病變與該病原的關係，確認受染細胞型別，從而有助於了解疾病的發病機理和病理過程。
免疫酶組化技術是通過共價鍵將酶連線在抗體上，製成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產物或具有一定電子密度的顆粒，於普通顯微鏡或電鏡下進行細胞表面及細胞內各種抗原成分的定位，根據酶標記的部位可將其分為直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多步法）等，用於標記的抗體可以是用免疫動物製備的多轉殖抗體或特異性單轉殖抗體，最好是特異性強的高效價的單轉殖抗體。直接法是將酶直接標記在第一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內的特定抗原物質。目前通常選用免疫酶組化間接染色法。
免疫組化的分類
免疫組織化學技術按照標記物的種類可分為免疫螢光法、免疫酶法、免疫鐵蛋白法、免疫金法及放射免疫自顯影法等。
實驗所用的標本
實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理切片和組織晶元）和冰凍切片，後者包括組織印片、細胞爬片和細胞塗片。
其中石蠟切片是製作組織標本最常用、最基本的方法，對於組織形態儲存好，且能作連續切片，有利於各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片製作過程對組織內抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本製作方法。
實驗所用的抗體
免疫組化實驗中常用的抗體為單轉殖抗體和多轉殖抗體。單轉殖抗體是乙個b淋巴細胞轉殖分泌的抗體，應用細胞融合雜交瘤技術免疫動物製備。多轉殖抗體是將純化後的抗原直接免疫動物後，從動物血中所獲得的免疫血清，是多個b淋巴細胞轉殖所產生的抗體混合物。
常用的染色方法
根據標記物的不同分為免疫螢光法、免疫酶標法、親和組織化學法，後者是以一種物質對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利於微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素—抗生物素染色法最常用。
免疫組化操作步驟
一免疫組化（lp法）操作步驟
1．切片常規脫蠟至水。如需抗原修復，可在此步後進行
2. 緩衝液洗3min/2次。
3. 為了降低內源性過氧化物酶造成的非特異性背景染色，將切片放在hydrogen peroxide block中孵育10-15分鐘。
4. 緩衝液洗5min/2次。
5. 滴加ultra v block，在室溫下孵育5分鐘以封閉非特異性的背景染色。
（注：孵育不要超過10分鐘，否則會導致特異性染色降低。如果一抗的稀釋液中含有5－10%正常羊血清，這一步可以省略。）
6. 緩衝液洗5min/2次。
7. 滴加一抗工作液37℃孵育1－2小時。（具體孵育時間和溫度由試驗者最終決定）
8. 緩衝液洗5min/2次。
9．滴加primary antibody enhancer(增強子)，在室溫下孵育20分鐘。
10 ．緩衝液洗5min/2次。
11 ．滴加hrp polymer(酶標二抗)，在室溫下孵育30分鐘。
（注：hrp polymer對光敏感，應避免不必要的光暴露並儲存在不透明的小瓶中。）
12 ．緩衝液洗5min/2次。
13 ．向1ml dab plus substrate(或aec plus substrate) 中滴加1-2滴 dab plus chromogen（或aec plus chromogen），混勻後滴加到切片上，孵育3－15分鐘。（具體時間由染色深淺決定。）
14 ．自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
二．免疫組化操作步驟
（1）石蠟切片脫蠟至水。
（2）3% h2o2室溫孵育5-10分鐘，以消除內源性過氧化物酶的活性。
（3）蒸餾水沖洗，pbs浸泡5分鐘x2（如需抗原修復，可在此步後進行）。
（4）5-10%正常山羊血清（pbs稀釋）封閉，室溫孵育10分鐘，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1-2小時或4 ℃過夜。
（5）pbs沖洗，5分鐘x3次。
（6）滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10-30分鐘。
（7）pbs沖洗，5分鐘x3次。
（8）滴加適量的辣根酶或鹼性磷酸酶標記的鏈黴卵白素工作液，37℃孵育10-30分鐘。
（9）pbs沖洗，5 分鐘x3次。
（10）顯色劑顯色3-15分鐘（dab或nbt/bcip）
（11）自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。
三. 免疫組化染色步驟
冰凍切片4-8um，室溫放置30分鐘後，入4℃丙酮固定10分鐘，pbs洗，5分鐘x3，用過氧化氫孵育5-10分鐘，消除內源性過氧化物酶的活性。
免疫組化的意義
近年來，隨著免疫組織化學技術的發展和各種特異性抗體的出現，使許多疑難腫瘤得到了明確診斷。在常規腫瘤病理診斷中，5%-10%的病例單靠染色難以作出明確的形態學診斷。尤其是免疫組化在腫瘤診斷和鑑別診斷中的實用價值受到了普遍的認可，其在低分化或未分化腫瘤的鑑別診斷時，準確率可達50%-75%。
免疫組織化學的臨床應用主要包括以下幾方面：
(1)惡性腫瘤的診斷與鑑別診斷；
(2)確定轉移性惡性腫瘤的原發部位；
(3)對某類腫瘤進行進一步的病理分型；
（4）軟組織腫瘤的**一般需根據正確的組織學分類，因其種類多、組織形態相像，有時難以區分其組織**，應用多種標誌進行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；
（5）發現微小轉移灶，有助於臨床**方案的確定，包括手術範圍的確定。
（6）為臨床提供**方案的選擇。
免疫組化的鏡檢
在鏡檢前可以通過相關資料查詢抗體的表達部位：細胞間質、細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核以及在其中的多個部位表達（如：mpo抗體表達在細胞膜、細胞漿、核膜、細胞核上）和表達組織（如：
vwf抗體在血管壁上表達，呈現環形）。
在顯微鏡下觀察時，先在40倍鏡下查詢組織及其範圍，然後檢視整個組織確定陽性產物的表達部位，然後將陽性產物表達部位置於視野正**，換高倍鏡觀察。
免疫組化經驗總結
做過病理實驗的人都知道，實驗看似容易，但真想把它做好，還是需要花上很長一段時間去積累和摸索經驗。我從事病理實驗已有6年多了，在這段時間裡，我做過許許多多病理相關實驗，剛開始啥也不懂，一味按照網上操作流程來做，但做的結果往往並不是十分理想，最終結果未能達到預期的效果。經過一段時間的瀏覽和學習，從一些在論壇內學習、請教，並結合實踐操作，我經歷了初級——查詢資料和摸索方法；中級——問題求助和不斷總結；高階——難題解答和經驗分享這三個階段，也學到了不少知識，積累了很多寶貴經驗，與大家一起分享下。
以免疫組化實驗為例
從我接觸的很多本科生和研究生中發現，他們的確是免疫組化「新手」，他們只注重如何做和最終的結果，但對為什麼這樣做不太感興趣。他們常按照網上所說的方法，摸索好的抗體濃度和條件後做出很漂亮的染色結果後，他們就認為自己已經掌握了免疫組化方法了，結果不求上進，更換一種新抗體後或實驗出現異常結果後就很難做出來了。當然，免疫組化對於我來說，做過很多，但也不能說什麼都會，只不過我做的多了，失敗多了和思考多了，可能比新手多了解一些其中的訣竅，拿來與大家進行分享。
此外，我個人經驗不可能面面俱到，還需要更多有經驗的高手一起分享、糾正和補充。在這裡，我需要感謝中華病理網、丁香通、小木蟲論壇給我很大的幫助，還有上海舜田生物技術人員老師給我實驗很多指導和幫助，讓我受益匪淺。
免疫組化個人感悟
1、其實免疫組化，我個人感覺方法和操作都不是很難，關鍵是結果出現異常時該如何去解決？我認為首先需要掌握好免疫組化實驗的原理，知道每乙個操作步驟的目的，這樣你才能大膽地去改革和糾正一些錯誤的步驟，如抗體孵育條件主要是抗體濃度、溫度、時間，這三者一般是相互成反比的（相對），其中濃度是最重要的先決條件，溫度決定反應的速度、時間決定反應的量。比如溫度有4℃、室溫、37℃。
我推薦4℃最佳，反應最溫和，背景較淺；而37℃反應速度較快，時間較短；室溫我不太提倡，除非你每次都把環境溫度控制在一定的範圍，否則，盡量選擇前兩者。
2、定位和定性是免疫組化最大的優勢。相比於其他蛋白檢測方法，免疫組化具有定位較直接準確、定性靈敏度高，是定位檢測分析首選方法。尤其對於有些因子的轉位研究十分有用。
3、免疫組化結果定量分析的前提是高質量的染色切片。免疫組化結果也能定量分析，但必須是背景染色淺而特異性染色較深的情況下，分析最為準確，這種原則可能也是我們日常審稿時判定研究結果的必備條件。
4、免疫組化實驗一定要設定陽性和陰性對照。陽性對照一般是用肯定表達這種抗原的切片來做；陰性對照一般是用pbs或非一抗替代一抗來進行反應，其餘步驟均一致。前者是排除方法和實驗系統有無問題；後者是排除有無一抗外的非特異性染色。
5、免疫組化技術掌握與否的鑑定標準是同一切片或不同切片中不同抗原均從摸索濃度或條件而做出優良的染色切片。我發現許多研究生把網上或者說明書摸索的反應條件、濃度、方法步驟，重複運用於同一性質的切片和同一種抗體，做出來後就覺得自己已經掌握了免疫組化方法，更換一種抗體後，居然連二抗的種屬**都拿錯了。失敗往往促進你去思考試驗原理和過程，成功有時也讓自己很自傲。
6、免疫組化的應用廣泛，是當前實驗研究的最重要方法之一。如今發sci**時，明顯感覺僅靠量化的資料來發文章很難，加一些形態學資料或**，老外十分歡迎，可能是怕你學術造假吧。當然也不能做假陽性或假陰性結果。
免疫組化實驗報告
二 石蠟包埋的注意事項 1 取材和固定 根據客戶要求將切取3mm大小的組織塊。2 脫水和透明 3 浸蠟和包埋 浸蠟 將透明的組織放入蠟杯 蠟杯 蠟杯 一般總的浸蠟時間為 小時左右。4 包埋 1 組織浸入石蠟後，包埋前將組織移入包埋用石蠟杯內。從恆溫箱取出置於三角架上，其下點燃酒精燈，以保持石蠟的溶解...
免疫組化試劑的正確使用
免疫組化試劑的選擇 一抗的正確選擇與使用 1.首菜單轉殖抗體 單轉殖抗體具有高特異性 高親和力 交叉反應少等特點，避免與細胞或組織蛋白的非特異性結合，減少染色背景。2.多轉殖抗體 最好是經樣本 種屬正常血清吸附過，盡可能的減少非特異性著色背景。加一抗前，用封閉液 可以是bsa或二抗 的正常動物血清 ...
大鼠腦組織石蠟切片的免疫組化染色體會
摘要 腦組織石蠟切片的染色結果，易出現切片染色不清楚，脫片 假陽性，假陰性出現。免疫組化這些結果的出現，與組織固定，抗原修復，內源性過氧化物酶活性的滅活，抗體質量，顯色試劑質量，蘇木素質量，時間上的把握及技術人員熟練程度有關，得出了免疫組化的過程的很多細節及各個步驟的主要的注意事項，提高腦組織切片的...