高階生物化學與分子生物學
綜合實驗報告
1、 實驗目的
以特定酶基因在大腸桿菌中的轉殖、表達和純化為主線，進行基因操作、蛋白質表達、親和層析純化等的訓練，通過集中訓練熟練生物化學和分子生物學實驗操作，為獨立開展研究生課題研究奠定實驗基礎。
2、 實驗原理
利用基因重組技術，將目的基因與載體質粒dna在體外進行重組，然後把這種重組dna轉化到感受態細胞，通過一定的誘導條件，使之在受體細胞內增值表達相應的目標蛋白。為了得到相應的目標蛋白，需要通過親和層析等手段純化目標蛋白。
三、 實驗內容
一）內容一：重組質粒的分離、鑑定與轉化
實驗1. 重組質粒的分離、純化及檢測
實驗2. 質粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳**
實驗3. 感受態細胞的製備、連線與轉化
二）內容二：重組蛋白在大腸桿菌中的表達
實驗4. 細菌的大量培養及重組蛋白的誘導
三）內容三：重組蛋白的提取、純化與鑑定
實驗5. 細菌的收集、破碎與目標蛋白的純化
實驗6. 目標蛋白的sds-page鑑定
實驗1 質粒dna的分離、純化及檢測
材料、裝置及試劑
一、材料
轉化的細菌，1.5ml塑料離心管,離心管架。
二、裝置
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)， 台式高速離心機，恆溫振盪搖床， 高壓蒸汽滅菌鍋，渦旋振盪器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恆溫水浴鍋等。
三、試劑
1. lb液體培養基(luria-bertani) ：稱取蛋白腖(tryptone)5 g，酵母提取物(yeast extract) 2.
5g，nacl 5g，溶於800ml去離子水中，用naoh調ph至7.5, 加去離子水至總體積500 ml，高壓下蒸氣滅菌20分鐘。
2. lb固體培養基：液體培養基中每公升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
3. 氨苄青黴素(ampicillin, amp)母液：配成 50mg/ml水溶液, -20℃儲存備。4. 質粒提取試劑盒。
操作步驟
1. 細菌的培養和收集
將含有質粒的菌種用無菌牙籤挑取平板上的單菌落接種到2-5ml lb液體培養基(含50μg/ml amp)中，37℃振盪培養約12小時至對數生長後期。
2. 取液體培養物1.2 ml於eppendorf 管中，然後6000 g/min離心2 min，棄上清。
3. 質粒的提取，參照質粒提取試劑盒說明。
4． -20℃儲存dna以備電泳檢測。
實驗2 質粒的酶切及瓊脂糖凝膠電泳**
材料、裝置及試劑
一、 材料
質粒； hindⅲ酶及其酶切緩衝液；瓊脂糖(agarose)
二、 裝置
水平式電泳裝置,電泳儀,台式高速離心機, 恆溫水浴鍋, 微量移液槍, 微波爐或電爐,紫外透射儀。
三、 試劑
50×tae電泳緩衝液； 6×電泳載樣緩衝液。
操作步驟
一、 dna酶切反應
1. 反應體系組成： 10x buffer 5 μl
hindiii 1 μl
plasmid 20 μl
h2o24 μl
2. 混勻反應體系後，將eppendorf管置於泡沫板上，37℃水浴保溫1小時，使酶切反應完全。
3. 停止反應，置於冰箱中儲存備用。
二、 瓊脂糖凝膠電泳
1. 取50×tae緩衝液4ml加水至200ml，配製成1×tae稀釋緩衝液，待用。
2. 膠液的製備：稱取0.4g瓊脂糖,置於200ml錐形瓶中,加入50ml 1×tae稀釋緩衝液，輕輕搖勻，溶脹30min，放入微波爐裡加熱至瓊脂糖全部熔化。
3. 膠板的製備：將有機玻璃膠槽放好，插上樣品梳子。將冷卻至50-60℃的瓊脂糖膠液小心地倒入膠槽內，使膠液形成均勻的膠層。
4. 加樣：取10μl酶解液與2μl 6×載樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。
5. 電泳：加完樣後，合上電泳槽蓋，立即接通電源。控制電壓保持在60-80v，電流在40ma以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，停止電泳。
6. 染色觀察和拍照。
7. **條帶，用**試劑盒。步驟參見試劑盒說明書。
實驗3 感受態細胞的製備、連線與轉化
材料、裝置及試劑
一、材料
e. coli bl21/de3菌株: amp-；無菌eppendorf管。
2、 試劑
lb液體培養基、t4 dna連線酶、氨苄青黴素、含amp的lb固體培養基
操作步驟
一、 連線反應
1. 取新的經滅菌處理的1.5ml eppendorf管, 編號。
2. 體系組成：共10μl
buffer1x
**的dn**段100 ng
t4 dna ligase1 μl
去離子水
3. 順序：去離子水、**的dn**段、**的dn**段、t4 dna ligase。
4. 混勻後用小離心機將液體全部甩到管底,於16℃保溫8-24h。
2、 e. coli感受態細胞轉化
3、 1. 從4℃冰箱中取200μl感受態細胞懸液，立即置冰上。
4、 2. 加入連線產物溶液(體積不超過10μl)，輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。
3. 42℃水浴中熱擊90秒,熱擊後迅速置於冰上冷卻3-5分鐘。
4. 向管中加入0.8ml lb液體培養基(不含amp)，混勻後37℃低轉速振盪培養45min，使細菌恢復正常生長狀態，並表達質粒編碼的抗生素抗性基因。
5. 將上述菌液搖勻後取200μl 塗佈於含amp的篩選平板上，正面向上放置5-10min，待菌液完全被培養基吸收後倒置培養皿，37℃培養16-24小時。
同時做兩個對照: 對照組1: (-)感受態細胞，此組正常情況下應不產生菌落。
對照組2: （+）1μl質粒，此組正常情況下應產生大量。
實驗四細菌的大量培養及外源蛋白的誘導
操作步驟
種子培養液的準備和外源蛋白的誘導表達
1. 取凍存的菌種，接種入裝有5-10ml lb培養基的瓶中，37℃，200rpm/min過夜培養後接入100ml lb培養基，接種濃度為2%。
2. 37℃，200rpm/min培養3小時後，將搖床溫度調節到誘導溫度20℃並平衡30min，然後加入iptg至終濃度0.4mm，繼續培養過夜。
實驗五細菌的收集、破碎與目標蛋白的純化
材料及試劑
一、材料
經誘導表達目的蛋白的大腸桿菌、ni-nta介質（ni親和介質）
二、試劑
1．緩衝液: 20mmol/l tris-hcl，ph8.0；
2．緩衝液配製10mm、50 mm、100 mm、250 mm咪唑。
操作步驟一（細菌破碎）
1. 將菌液轉入大離心瓶中，離心收菌，4000rpm，10min；
2. 倒掉上清，將菌體懸於10ml緩衝液中 ，超聲破碎細菌；
3. 將破菌產物離心，12000rpm，15 min；
4. 分別對上清和沉澱留樣，通過sds聚丙烯醯胺凝膠電泳鑑定表達情況和蛋白
操作步驟二（目標蛋白純化）
1. 處理介質：向柱中加入0.5ml nita介質後，用5倍柱體積的去離子水洗滌介質；再用5倍柱體積的緩衝液洗滌介質； 以下步驟根據蛋白性質在16℃下進行操作；
2. 加入蛋白樣品：加入超聲破菌後的蛋白上清樣品；
3. 洗滌雜蛋白：用5倍柱體積的10mm咪唑洗滌介質；
4. 洗滌目標蛋白：用50 mm、100 mm、250 mm不同濃度的咪唑各2.5ml，梯度洗脫介質 ，**流出液，儲存於4℃，用sds聚丙烯醯胺凝膠電泳進行檢測。
實驗六目標蛋白的sds-page鑑定
試劑 10％十二烷基硫酸鈉（sds）貯存液、30%丙烯醯胺單體液、濃縮膠緩衝液1m ph6.8的tris緩衝液和分離膠緩衝液1.5m ph8.
8的tris緩衝液、10%過硫酸銨、temed、tris-甘氨酸電泳緩衝液、樣品處理液、染色液、脫色液
操作步驟
一、 蛋白電泳用膠的配製
1. 安裝玻璃板。
2. 按表1中給出的數值在一小燒杯中配製分離膠溶液。
表2-1 sds不連續電泳凝膠配方
3. 迅速在玻璃板的間隙中灌注丙稀醯胺溶液，留出灌注濃縮膠所需的空間。再在膠面上小心注入一層水（約2～3 mm）高，以阻止氧氣進入凝膠溶液。
4. 分離膠聚合完全後（約30分鐘），傾出覆蓋水層，再用濾紙吸淨殘留水。
5. 按表1中給出的濃縮膠配置方法製備濃縮膠。注意一旦加入temed，馬上開始聚合，故應快速操作。
6. 在聚合的分離膠上直接灌注濃縮膠，立即在濃縮膠溶液中插入乾淨梳子。
7. 在等待濃縮膠聚合時，可對樣品進行處理，在樣品中按1：1體積比加入樣品處理液，在100℃加熱5min以使蛋白質變性。
8. 濃縮膠聚合完全後（30-60 min），小心移出梳子。將凝膠固定於電泳裝置上，上下槽各加入tris-甘氨酸電泳緩衝液。
二、上樣電泳
1. 按預定順序加樣，加樣量通常為10～ 25μl。
電泳檢測樣品至少包括：蛋白marker、上樣液（原液）、上樣後的穿透液、10mm咪唑沖洗液、50mm咪唑沖洗液、100mm咪唑沖洗液、250mm咪唑沖洗液。
2. 將電泳裝置與電源相接，凝膠上所加電壓為8v/ cm。當染料前沿進入分離膠後，把電壓提高到15 v/ cm，繼續電泳直至溴酚藍到達分離膠底部上方約1 cm，然後關閉電源。
生物化學與分子生物學知識總結
第一章蛋白質的結構與功能 1.組成蛋白質的元素主要有c h o n和 s。2.蛋白質元素組成的特點各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16 100克樣品中蛋白質的含量 g 每克樣品含氮克數 6.25 100 3.組 體蛋白質的20種氨基酸均屬於l 氨基酸氨基酸 4.可根據側鏈結構和理化性質進行分類 非極...
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