其中fitc應用最廣，為黃色結晶，最大吸收光波長為490～495nm,最大發射光波長520～530nm，可呈現明亮的黃綠色螢光。fitc分子中含有異硫氰基，在鹼性(ph9.0～9.
5)條件下能與igg分子的自由氨基結合，形成fitc-igg結合物，從而製成螢光抗體。
抗體經螢光色素標記後，不影響與抗原的結合能力和特異性。當螢光抗體與相應的抗原結合時，就形成了帶有螢光性的抗原抗體複合物，從而可在螢光顯微鏡下檢出抗原的存在。
（1） 將待交聯的蛋白（濃度1mg/ml）對交聯反應液透析三次(4 ℃)，至ph＝9.0。
交聯反應液配製方法：7.56g nahco3，1.06g na2co3，7.36g nacl，加水定容至1 l。
（2）將fitc溶於dmso中，濃度為1mg/ml。每次交聯使用的fitc均應新鮮配製，避光。
（3）按p:f（蛋白質：fitc）=1mg:150μg 的比例將fitc緩慢加入於抗體溶液中，邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻，暗處4 ℃反應8 hr。
（4）加入5mol/l的nh4cl至終濃度50mmol/l， 4 ℃終止反應2 hr。
（5）將交聯物在pbs中透析四次以上，至透析液清亮。
（6）交聯物的鑑定
蛋白濃度(mg/ml) = [ a280– 0.31×a495 ] / 1.4
f/p比例: 3.1×a495 / [a280 – 0.31×a495 ]，該值應介於2.5 6.5之間。
（7） fitc交聯的蛋白應置於ph7.4的磷酸鹽緩衝液中，加入0.1% nan3、1% bsa，4℃暗處儲存。
二,免疫螢光組織化學染色方法
1.直接法簡便、快速，用已知特異性標記螢光的一抗與組織細胞內抗原結合。
操作流程：
(1)冰凍切片經固定，涼幹pbs洗；石蠟切片脫蠟至水，消化30min，pbs洗。
(2)適當稀釋螢光抗體滴加在組織切片上，溼盒內37℃溫育1h，pbs洗3×3min。
(3)0.01%伊文氏藍襯染1～3min，pbs洗3×3min，蒸餾水洗2次，除去nacl結晶。
(4)ph9.0緩衝甘油封片。
(5)鏡檢
2.間接法是直接的重要改進，先用標記的已知特異性一抗與組織細胞內抗原結合，隨後用間接螢光標記二抗與一抗特異性結合。
操作流程 :
(1)冰凍切片經固定，涼乾後pbs洗；石蠟切片脫蠟至水，pbs洗，酶消化，pbs洗3×3min。
(2)適當稀釋特異性一抗，37℃孵育1h，或室溫4h，或4℃過夜，pbs洗3×3min。
(3)螢光標記二抗適當稀釋37℃ 30min，pbs洗3×3min。
(4)0.01%伊文氏藍襯染1～3min，pbs洗3×3min。
(5)封片，鏡檢。
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