一．配膠
1． 注意一定要將玻璃板洗淨，最後用ddh2o沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置於乾淨的紙巾晾乾。
2． 分離膠及濃縮膠均可事先配好（除ap及temed外），過濾後作為儲存液避光存放於4℃，可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡（否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件者可真空抽吸3分鐘），加入10%ap（0.7~0.8:
100, 分離膠濃度越高ap濃度越低，15%的分離膠可用到0.5:100）及temed（分離膠用0.
4:1000, 15%的可用到0.3:
1000，濃縮膠用0.8：1000）即可
3． 封膠：灌入2/3的分離膠後應立即封膠，膠濃度＜10%時可用0.1%的sds封，濃度＞10%時用水飽和的異丁醇或異戊醇，也可以用0.
1%的sds。封膠後切記，勿動。待膠凝後將封膠液倒掉，如用醇封膠需用大量清水及ddh2o沖洗乾淨，然後加少量0.
1%的sds，目的是通過降低張力清除殘留水滴。
4．灌好濃縮膠後1h拔除梳子，注意在拔除梳子時宜邊加水邊拔，以免有氣泡進入梳孔使梳孔變形。呼出梳子後用ddh2o沖洗膠孔兩遍以去除殘膠，隨後用0.1%的sds封膠。
若上樣孔有變形，可用適當粗細的針頭撥正；若變形嚴重，可在去除殘膠後用較薄的梳子再次插入梳孔後加水拔出。30min後即可上樣，長時間有利於膠結構的形成，因為肉眼觀的膠凝時其內部分子的排列尚未完成。
二．樣品處理
1．培養的細胞（定性）：
⑴ 去培養液後用溫的pbs沖洗2~3遍（冷的pbs有可能使細胞脫落）。
⑵ 對於6孔板來說每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。
⑶ 100℃，1min。
⑷ 用細胞刮刮下細胞後在ep管中煮沸10min，期間vortex 2~3次。
⑸ 用乾淨的針尖挑絲，如有團塊則將團塊棄掉，如果沒有團塊但有拉絲現象，則可以將ep管置於0℃後在14000~16000g離心2min，再次挑絲。若無團塊也無絲狀物但溶液有些粘稠，可通過使用1ml注射器反覆抽吸來降低溶液粘滯度，便於上樣。
⑹ 待樣品恢復到室溫後上樣。
2．培養的細胞（定量）：
⑴ 去培養液後用溫的pbs沖洗2~3遍（冷的pbs有可能使細胞脫落）。
⑵ 加入適量的冰預冷的裂解液後置於冰上10~20min。
⑶ 用細胞刮刮下細胞，收集在ep管後超聲（100~200w）3s，2次。
⑷ 12000g離心，4℃，2min。
⑸ 取少量上清進行定量。
⑹ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱後加loading buffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃乙個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
3．組織：
⑴ 勻漿對於心肝脾腎等組織可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml裂解液。可手動或電動勻漿。注意盡量保持低溫，快速勻漿。
⑵ 12000g離心，4℃，2min。
⑶ 取少量上清進行定量。
⑷ 將所有蛋白樣品調至等濃度，充分混合沉澱加loading buffer後直接上樣最好，剩餘溶液（溶於1×loading buffer）可以低溫儲存，-70℃乙個月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上樣前98℃，3min。
三．電泳
1．上樣前將膠板下的氣泡趕走。
2．所有蛋白樣品調至等濃度後上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×loading buffer上樣，marker也用1×loading buffer調整至與樣品等體積。
2．以初始電壓為45v時的電流強度進行穩流電泳，當電壓達65v時改為穩壓電泳。
3．在目的蛋白泳動至距膠下緣1cm以上結束。
四．轉膜
1．電泳結束前20分鐘左右戴上手套開始準備：
溼轉使用常規電轉液：tris 3.0g，gly 14.4g， m-oh 200ml，加去離子水至1,000ml。乾轉則取此轉移液，每50ml加入10%sds180ul。
浸泡nc膜：將nc膜平鋪於去離子水面，靠毛細作用自然吸水後再完全浸入水中10min以排除氣泡，隨後浸泡入轉移液中。pvdf膜則在m-oh中浸泡20min以上後轉入轉移液中。
將濾紙也浸入轉移液中。
2．取膠：
將膠卸下，保留30-100kd或分子量範圍更廣些的膠（以便以後雜其他感興趣的蛋白），左上切角，在轉移液中稍稍浸泡一下，置於潔淨玻璃板上，按順序鋪上膜與每側一張（乾轉每側三張）濾紙。注意用玻棒逐出氣泡，剪去濾紙與膜的過多部分（尤其是乾轉，以防止短路）
3．轉膜：
溼**電轉槽用去離子水淋洗晾乾，加入1,000ml電轉液。將膠平鋪於海綿上，滴加少許電轉液再次驅趕氣泡，封緊後放入電轉槽，注意膜在正極一側。
降溫，將電泳槽置於冰水混合物中。恆流100ma過夜，或400ma，4h。注意不同蛋白的要求不同。
幹**用電轉液淋洗石墨電極，濾紙吸乾，鋪上膠，再滴少許電轉液，以1.5ma/cm2凝膠面積轉移1-2小時。負載電壓不宜超過1v/cm2膠面積。
五．封閉及雜交
1．封閉：
將膜從電轉槽中取出，去離子水與pbst或ttbs稍加漂洗，浸沒於封閉液中緩慢搖盪一小時。必要時可先用麗春紅染色（2%乙酸，0.5%麗春紅的水溶液）觀察蛋白條帶，再用去離子水和ttbs將麗春紅洗脫後封閉，如用蛋白marker則可省略此步。
2．結合一抗：
一抗的準備：使用反貼法時每張3×9cm2膜約需2ml一抗稀釋液。
反貼法的操作：含一抗的封閉液滴加於搖床的塑料膜上，將western膜從封閉液中取出，濾紙貼角稍吸乾，正面朝下貼在一抗上，注意不要留下氣泡，室溫下輕搖孵育一小時或4℃靜置過夜。在反應體系外面罩一濕潤平皿以防止液體過多蒸發。
3．洗滌：
一抗孵育結束後，用pbst或ttbs漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
4．結合二抗：
根據一抗**選擇合適的二抗，根據鑑定方法選擇hrp或ap標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖一小時。
5．洗滌：
二抗孵育結束後，用pbst或ttbs漂洗膜後再浸洗三次，每次5-10min。
六．發光鑑定
一般使用辣根過氧化物酶hrp-ecl發光法或鹼性磷酸酶ap-nbt/bicp顯色法。
1．hrp-ecl發光法：
將a、b發光液按比例稀釋混合。膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸乾，反貼法覆於a、b混合液滴上，熄燈至可見淡綠色螢光條帶（5min左右）後濾紙貼角吸乾，置於保鮮膜內固定於片盒中，迅速蓋上膠片，關閉膠盒，根據所見螢光強度**。取出膠片立即完全浸入顯影液中1-2min，清水漂洗一下後放在定影液中至底片完全定影，清水沖淨晾乾，標定marker，進行分析與掃瞄。
2．ap-nbt/bicp顯色法：
每片nbt/bicp可溶解於30ml水中，使用前將一片分裝在30個 ep管中，每張3×9cm的膜取一管配成1ml即可。將pbst或ttbs洗滌過的膜用去離子水稍加漂洗，濾紙貼角吸乾，反貼法覆於nbt/bicp溶液液滴上，並用不透明物體（如報紙）遮擋光線，顯色20s後每10s觀察一次，至條帶明顯或有本底出現時將膜揭起置去離子水中漂洗後放濾紙上晾乾即可觀察與掃瞄。
七．增強敏感性
若目的條帶未出現，或很淡，可試用以下方法增強發光強度：
1． 用清水漂洗膜數分鐘，重加發光液進行**，可延長**時間。
2． 將膜在pbst或ttbs中洗滌30min或更長，期間至少換2次液。
3． 封閉40~60min
4． 一抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。
5． pbst或ttbs洗膜20min，期間換2次液。
6． 二抗雜交，37℃ 1h。
7． pbst或ttbs洗膜20min，期間換2次液。
8． 發光鑑定。
9． 若條帶仍未出現或很淡，可以再用pbst或ttbs洗滌膜20min，期間換2次液。
10．三抗雜交，室溫1h。37℃ 1h 會更強，但可能增加非特異條帶。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此時三抗可以選擇兔抗羊或鼠抗羊等。
11．pbst或ttbs洗滌膜20min，期間換2次液。
12．發光鑑定。
八．nc膜的多次使用
一張nc膜可使用多次，對多種蛋白進行雜交，步驟與「七．增強敏感性」相近。
1． 如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置差別較大則只需用pbst洗滌掉發光液（10min×3次）後從一抗雜交開始，後續步驟同前。
2． 如前次雜交結果條帶距離本次雜交的蛋白的預計位置較近則需更強的洗滌，可用 strip液（可用雜交袋）於室溫搖動洗滌30min~60min，然後用pbst洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。
3． 對於雜交若干次的膜，如果常規洗滌方法不易去掉眾多條帶，可用強度更強的自配的strip液（可用雜交袋）於50℃洗滌30min，然後用pbst洗滌10min×3次，再從封閉開始，後續步驟同前。
Western blot基本操作步驟教學內容
一 細胞蛋白的提取 棄去培養基，加入預冷的pbs洗一遍，加入的ripa裂解液 含1mm pmsf 100 每10ml加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各一片，六孔板每孔150 250 l，60mm 15mm培養皿300 400 l，於冰上裂解約5分鐘，裂解總液12000rpm離心10 min。取上清，用b...
western blot通用配方
ddh2o 1.76ml 1m tris hcl ph 6.8 0.24ml 甘油 1ml 10 w v sds 0.8ml 巰基乙醇 0.2ml 2 將4 張濾紙剪成與海棉大小一致的方形 3 配 1 轉膜工作液 10 轉膜緩衝液 running buffer 80ml 無水乙醇80ml 水640m...
Western Blot的準備工作 原創
jesse wang 2010 04 前一天的準備工作 1 清洗4個小燒杯，玻璃板，梳子，晾乾。2 清洗若干玻璃培養皿 6個15ml離心管，1個50ml離心管，烘乾。3 檢查電泳緩衝液 轉膜緩衝液和tbst是否足夠。電泳 1.籃子 2.10微公升的槍和槍頭 3.冰 4.蛋白樣品，marker 5.廢...