ddh2o 1.76ml 1m tris-hcl ph 6.8 0.24ml
甘油 1ml 10%（w/v）sds 0.8ml
-巰基乙醇 0.2ml
（2）將4 張濾紙剪成與海棉大小一致的方形
（3）配（1×)轉膜工作液
(10×)轉膜緩衝液（running buffer） 80ml
無水乙醇80ml
水640ml
800ml
（4）將膠泡在（1×)轉膜工作液中（防止膠乾掉，最好不要用水，水泡膠會漲）
（5）用尺子量膠大小，裁pdvf膜（不要用手蹭膜，手上有蛋白）
（6）pdvf膜先在無水乙醇中泡約1min,然後泡到（1×)轉膜工作液中。（pdvf膜為疏水性的，先在乙醇中泡會使其親水性好）
（7）將海綿和濾紙在水中浸濕，然後按照一下順序(整個操作過程中保證膜不能幹)：
白板 — 海綿 — 兩層濾紙--pdvf膜（靠正極）--膠（靠負極）（用小試管排氣泡）--兩層濾紙—海綿（用小試管排氣泡）--夾住—放入膠槽中（白板靠紅，黑板靠黑，保證電極方向不要錯）--在膠槽中加入轉子—倒入（1×)轉膜工作液—在膠槽中放入冰袋—80v～100v恆壓，60min(該條件可以轉移25kd～90kd的蛋白)
(8)封閉：在封閉液中室溫，搖1h或者4℃靜置過夜。
（9）漂洗：將pvdf 膜在tbst 緩衝液中漂洗3 次，每次10 分鐘；
(10)一抗：適量的一抗加到tbst+脫脂奶粉(或者是tbst+1% gelatine)
室溫搖1h.
(11) 漂洗：將pvdf 膜在tbst 緩衝液中漂洗3 次，每次10 分鐘
(12) 二抗：適量的二抗加到tbst+脫脂奶粉(或者是tbst+1% gelatine)
室溫搖1h.
（13）漂洗：將pvdf 膜在tbst 緩衝液中漂洗3 次，每次10 分鐘
兩種顯帶方式：
**法（14）用紙將pvdf 膜上的水分吸乾，然後將將pvdf 膜放在保鮮膜上，將ecl試劑盒中的a液和b液按照1：1的比例混勻（見說明書）後均勻覆蓋到pvdf 膜上1min,然後用紙將pvdf 膜上的溶液吸乾，放入x光片的暗盒中。
（15）在暗室中，使用紅光燈，將顯影液，水，定影液分別倒入三個盤子中，然後取出x光片剪成合適大小，放入含有pvdf 膜的暗盒中，**一定時間後取出x光片，放入顯影液中顯影，檢測顯影的情況，當發現x光片中有條帶時，放入水中清洗光片，然後在定影液中定影。然後在黑暗情況下將光片和顯影液定影液收好。顯影液和定影液應為無色透明，若發現顏色異常、有沉澱或長菌需重配。
膜上顯色法：
（14）增強型hrp-dab底物顯色試劑盒；包括1×hrp緩衝液，試劑a，試劑b和試劑c，三者新增的體積比為1ml 1×hrp緩衝液+50μl試劑a+50μl試劑b+50μl試劑c。顯色劑體積依照個人的需要配置。
將pdvf膜置於顯色劑中，暗處靜置8-10min，接著用水沖洗以終止反應，然後將紙吸乾pdvf膜上殘餘的水，掃瞄器**即可。
westernblot的溶劑配方和具體步驟
1.製樣 以提動物組織總蛋白為例 1 組織洗滌後加入3 倍體積pbs，0 研磨。2 加入5 stop buffer 1ml 3 180w,6mins，0 超聲波破碎 4 5000rpm，5mins 離心，取上清。5 加入reb 9.5ml加入0.5ml 溴酚藍 9.5ml加入0.5ml 6 煮沸，1...
western blot操作注意事項
一 配膠 1 注意一定要將玻璃板洗淨，最後用ddh2o沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置於乾淨的紙巾晾乾。2 分離膠及濃縮膠均可事先配好 除ap及temed外 過濾後作為儲存液避光存放於4 可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡 否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件...
Western Blot的準備工作 原創
jesse wang 2010 04 前一天的準備工作 1 清洗4個小燒杯，玻璃板，梳子，晾乾。2 清洗若干玻璃培養皿 6個15ml離心管，1個50ml離心管，烘乾。3 檢查電泳緩衝液 轉膜緩衝液和tbst是否足夠。電泳 1.籃子 2.10微公升的槍和槍頭 3.冰 4.蛋白樣品，marker 5.廢...