1. 製樣（以提動物組織總蛋白為例）
1） 組織洗滌後加入3 倍體積pbs，0℃研磨。
2） 加入5×stop buffer 1ml
3） 180w, 6mins，0℃超聲波破碎
4） 5000rpm，5mins 離心，取上清。
5） 加入reb(9.5ml加入0.5ml)，溴酚藍（9.5ml加入0.5ml）
6） 煮沸，10min
7） 分裝，於-20℃儲存，用時取出，直接溶解上樣。
2．電泳（sds-page）
建議欲檢測抗原10－30kd, 用15％膠；30－100kd, 用10％膠；100－200kd，用7.5％膠。
1）配膠（one piece）
a.分離膠。(共8ml，單位ml)
7.5％ 10％ 15%
2×sep. buffer 44 4
30％ gel.sol 2.0 2.7 4
ddh2o 1.9 1.2 0
temed 8ul 8ul8ul
10%aps 80ul 80ul 80ul
b. 濃縮膠。(共3.5ml，單位ml)
3％2×stacking. buffer 1.7
30％ gel.sol 0.35
ddh2o1.4
temed 5ul
10%aps50ul
2)點樣。
上樣蛋白量不應超過30ug/mm2. (載荷麵即：如果你的膠槽是5mm×1mm, 則載荷面為：1mm×5mm=5mm2)，
3）電泳。
開始用80v電壓，但是當溴酚藍至分離膠時，用100-120v電壓。
4）轉移（一塊膠）。
a.半乾法。
a. 取六張濾紙（bio-rad，1mm），三張做上層濾紙，三張做下層。其中，上層濾紙一定要比較乾淨，無汙染。用前都用transfer buffer 浸泡至少五分鐘。
b. 準備硝酸纖維素薄膜，用時先用甲醇浸泡1-3min.倒掉後，再用transfer buffer 浸泡。
c. 做三明治。陽極上鋪三張下層濾紙，再浸泡過的膜，再鋪膠，然後鋪三實驗方法互助區——蛋白區張上層濾紙，最後鋪上三張上層濾紙，蓋上陰極。
注意每層之間不能有氣泡。膜上用鉛筆畫出膠的邊緣。標上下。
d. 轉移，0.8ma/cm2-3ma/cm2.
經驗是：100kd-200kd，用2ma/cm2，2hrs;30-100kd用1.0-2.
0ma/cm2，40mins-1.5h；10kd-30kd％用0.5-0.
8ma/cm2，15mins-40mins.
b.濕法。
a. 取四張濾紙，兩張做上層濾紙，兩張做下層。其中，上層濾紙一定要比較乾淨，無汙染。
b. 準備硝酸纖維素薄膜，用時先用甲醇浸泡1-3mins.倒掉後, 再用transfer buffer 浸泡。
c. 做三明治。
e. 轉移。抗原≥100kd, 先28v轉移1h, 然後84v轉移14-16h, ≤100kd， 則63v轉移4-16h.（300ma,2h，基本通用）
3. 封閉：5％牛奶4℃封閉過夜，或rt 1hr.
4. 第一步反應：5％牛奶或2％bsa稀釋抗體（稱一抗），稀釋比例按抗體說明,室溫孵育1hr，
5. 洗滌：tbst 洗5 mins 3-5 次。時間可以短點
6. 第二步反應：將膜跟5％牛奶或2％bsa稀釋的2 抗一起孵育，室溫1hr。
7. 洗滌：tbst 洗5 mins 3-5 次。（視具體蛋白，抗體而定，一般要洗半個小時以上。效果好些，個人經驗）
8. 顯色：
western blot 所需buffer 的配方是
主要的buffer有：
1） 2×separation buffer (ph: 8.8)
0.75m tris.hcl 90.825g
0.2% sds 10ml 20% sds
total: 1000ml
2) 30% gel solution
0.8% kis-aciylamide 0.8g
29.2% aciylamide 29.2g
total: 100ml
3）10％ aps: 0.1g 溶於1.0ml ddh2o.
4) 2×stacking buffer(ph: 6.8)
0.2m tris 15.14g
0.2% sds 1g or 5ml 20% sds
total: 500ml
5) 10×running buffer(ph: 8.3)
250mm tris 60.55g
1.9m glycine 285.27g
1% sds 20g or 100ml 20% sds
total: 2 liters
6) semi-dry transfer buffer(ph:8.3):
48mm tris 5.8g
39mm glycine 2.9g
0.037% sds 0.37g
20% meoh 200ml
total: 1000ml
7) wet transfer buffer 1(ph: 8.3): （20－400kd）
50mm tris 5.8g
380mm glycine 29g
0.1% sds 1.0g
20% meoh 200ml
total: 1000ml
8) wet transfer buffer 2(ph: 8.3) ＜80kd
25mm tris 5.8g
190mm glycine 29g
20% meoh 200ml
total: 1000ml
9) blocking buffer:
5% milk 5g
tbst 100ml
※：奶粉為脫脂奶粉。
10) 10×tbs (ph: 7.6)
nacl 80g
tris 30g
total: 1000ml
11) tbst (ph: 7.4)
nacl 25mm
tris 100mm
tween-20 0.2%
total: 1000ml
12) 5×stop buffer (ph: 6.7)
20% glycerol 100ml
10% sds 50g
250mm tris 15.14g
用時取9.0ml，加入0.5ml β-me和0.5ml 溴酚藍，可製成sample buffer。
Western Blot的準備工作 原創
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