一、細胞蛋白的提取
棄去培養基，加入預冷的pbs洗一遍，加入的ripa裂解液（含1mm pmsf(100×)，每10ml加蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm培養皿300-400μl，），於冰上裂解約5分鐘，裂解總液12000rpm離心10 min。取上清，用bca法測定蛋白濃度。用於western blot的蛋白樣品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液補齊到所需上樣體積。
離心，使蛋白沉底。將ep管於沸水中煮5min，變性，之後再離心後準備上樣。
二、bca法測蛋白濃度操作步驟
將蛋白標準配製溶液溶解蛋白標準（bsa），配製成5mg/ml的蛋白標準溶液，10μl 分裝，-20℃冷凍儲存。
完全溶解蛋白標準品，取10l用pbs稀釋至100l，使終濃度為0.5mg/ml。
據樣品數量，按50體積bca試劑a加1體積bca試劑b(50:1)配製適量bca工作液，充分混勻。bca工作液室溫24小時內穩定。
將標準品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20l加到96孔板的標準品孔中，加稀釋標準品的溶液補足到20l。
加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中（可以通過預實驗摸索稀釋倍數），加pbs到20l。
各孔加入100l bca工作液，37℃放置30分鐘。
測定580nm條件下吸光度。根據標準曲線計算出蛋白濃度。
三、western blot基本操作步驟
1、溶液配製：
①runnig buffer(1×)：sds runnig buffer（20×）50ml，加miliq水至1l；
②transfer buffer(1×): transfer buffer(10×)100ml,甲醇200ml（20%，v/v），加miliq水至1l；
③tbst緩衝液
1m tris·hcl（ph7.6）： 60.5g tris-base，加入約30ml濃鹽酸，調ph至7.6，加miliq水至500ml。
tbs緩衝液（10×）：1m tris·hcl 100ml+80g nacl加miliq水1l
tbst緩衝液（1×）：tbs緩衝液（10×）100ml+0.5ml tween-20（0.05%，v/v），加miliq水至1l。
④封閉液：5% bsa（5g/100ml，稱取1g bsa至20ml tbst，充分混勻溶解）
2、樣品準備與加樣
①用4×sds loading buffer, 10×reducing與蛋白質樣品混合，並將此 ep 管放在水浴鍋中沸水煮 5min，使蛋白質變性。
②將預製膠固定到電泳裝置中，並在裝置中加滿runnig buffer(1×)，內槽加入0.5ml抗氧化劑，小心拔下梳子；
③向上樣孔中加入一定體積的蛋白樣品（總蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照實驗要求設定marker量），向空白孔中加入一定體積的加樣緩衝液(loading buffer)。
注意採用相同（或相近）的上樣體積，以保證蛋白的各帶寬度相同。防止體積較大的上樣孔中的蛋白質將向相鄰的泳道擴散。
3、電泳
將電泳裝置與電源連線。調節電壓為100-200v，電泳50min，直至溴酚蘭接近分離膠的底部，然後關閉電源並撤去連線的導線。
拆除電泳裝置：先倒掉電泳緩衝液，連同槽一起將凝膠夾層取出，小心的撬起凝膠外層塑料板，使凝膠暴露出來，切去濃縮膠以及無蛋白樣品的凝膠部分（將膠留在短的一面塑料板上）。
4、轉膜（溼轉）
ps:消費者分析①將轉膜液（1× transfer buffer）放於大飯盒內，泡4片海綿，剪4片濾紙、1片pvdf膜，pvdf膜於甲醇中活化30s，取出置於轉膜液中；
（4） 創新能力薄弱②按照2層海綿+2層濾紙+膠+膜+2層濾紙+5層海綿（填滿）的順序組裝轉膜裝置，注意組裝此裝置時一定要保證濾紙、膜、凝膠精確對齊並不留氣泡；
③將組裝好的裝置放入電轉槽，合上蓋子，電轉槽置於冰浴，接通電源，調節電壓為15v，時間為16~18h（或恆流300ma, 3h）。顯示紅燈亮後，按下start後，開始轉膜。
據上述部分的分析可見，我校學生就達4000多人。附近還有兩所學校，和一些居民樓。隨著生活水平的逐漸提高，家長給孩子的零用錢也越來越多，人們對美的要求也越來越高，特別是大學生。
他們總希望自己的無論是衣服還是首飾都希望與眾不同，能穿出自己的個性。但在我們美麗的校園裡缺少自己的個性和琳琅滿目的飾品，所以我們的小飾品店存在的競爭力主要是南橋或是市區的。這給我們小組的創業專案提供了乙個很好的市場機會。
轉膜方向為蛋白從負極（黑色）轉向正極（紅色）。
（4） 創新能力薄弱
5、免疫印跡反應及化學發光檢測
「碧芝」的成功歸於他的唯一，這獨一無二的物品就吸引了各種女性的眼光。轉膜完畢後，根據目的蛋白分子量將膜剪成不同的條帶，用封閉液（5% bsa）室溫封閉 2h。棄封閉液，加入用新的封閉液稀釋的一抗（可**），室溫2h或4℃過夜。
用 tbst清洗 3 次，10min/次。
五、創業機會和對策分析二抗（可**）室溫孵育1小時，室溫 1xtbst 洗滌 3次，每次約10 min。
此步開始避光操作：將膜浸入化學發光底物工作液（a液：b液=1:1，終體積0.5-1ml即可）中，顯色2分鐘，放入bio-rad凝膠成像系統中顯影。
8、你是如何得志diy手工藝製品的？
圖1-4大學生購買手工藝製品目的
內參分子量：β-actin：42 kda
創業首先要有「風險意識」，要能承受住風險和失敗。還要有責任感，要對公司、員工、投資者負責。務實精神也必不可少，必須踏實做事gapdh：36 kda
tubulin: 51kda
western blot操作注意事項
一 配膠 1 注意一定要將玻璃板洗淨，最後用ddh2o沖洗，將與膠接觸的一面向下傾斜置於乾淨的紙巾晾乾。2 分離膠及濃縮膠均可事先配好 除ap及temed外 過濾後作為儲存液避光存放於4 可至少存放1個月，臨用前取出室溫平衡 否則凝膠過程產生的熱量會使低溫時溶解於儲存液中的氣體析出而導致氣泡，有條件...
western blot通用配方
ddh2o 1.76ml 1m tris hcl ph 6.8 0.24ml 甘油 1ml 10 w v sds 0.8ml 巰基乙醇 0.2ml 2 將4 張濾紙剪成與海棉大小一致的方形 3 配 1 轉膜工作液 10 轉膜緩衝液 running buffer 80ml 無水乙醇80ml 水640m...
Oracle基本操作
2013 12 10 作者 編輯 眼鏡丟了點選進入論壇 一，約束操作 1 更改約束名稱 alter table tname rename constraint oldname to newname 2 刪除約束 alter table tname drop constraint cname 3 停止...