附件9：
化妝品中6-甲基香豆素的檢測方法
高效液相色譜法
1 範圍
本方法規定了用高效液相色譜法測定化妝品中6-甲基香豆素的含量。
本方法適用於膏霜、乳、液、粉類化妝品中6-甲基香豆素的測定。
暫無實驗資料表明本方式適用於蠟質類化妝品中6-甲基香豆素含量的測定。
2 方法提要
樣品在經過提取後，經高效液相色譜儀分離，紫外檢測器檢測，根據保留時間定性，峰面積定量，以標準曲線法計算含量。必要時，採用氣相色譜-質譜（gc/ms）進行確證。本方法對6-甲基香豆素的檢出限為0.
00005g，定量下限為0.00017g。若取1g樣品，本方法對6-甲基香豆素的檢出濃度為0.
000005%，最低定量濃度為0.000017%。
3 試劑和材料
除另有規定外，所用試劑均為分析純，水為超純水。
3.1 甲醇：色譜純。
3.2 6-甲基香豆素，純度≥99.0%。
3.3 磷酸二氫鈉
3.4 磷酸二氫鈉緩衝溶液[c(nah2po4)=0.02mol/l，ph =3.
5）：稱取3.12g磷酸二氫鈉，加水溶解並稀釋至1000ml，磷酸調ph值至3.
5。3.5 6-甲基香豆素標準儲備溶液[(6-甲基香豆素)=1.0g/l）]：
精密稱取6-甲基香豆素0.1000g於100 ml容量瓶中，加甲醇（3.1）溶解並稀釋至刻度，即得標準儲備溶液（濃度為1g/l）。
3.6 系列濃度6-甲基香豆素標準溶液：精密量取標準儲備溶液（3.
5）5ml置於50ml量瓶中，即得100μg/ ml的標準溶液，再分別精密量取0.1 ml，0.5 ml，1.
0 ml，3.0 ml，5.0 ml，10 ml於100ml的量瓶中，加甲醇（3.
1）溶解並稀釋至刻度。即得濃度分別為0.1μg/ ml、0.
5μg/ ml、1.0μg/ ml、3.0μg/ ml、5.
0μg/ ml、10.0μg/ ml的標準溶液。
4 儀器
4.1 高效液相色譜儀：具紫外檢測器。
4.2 氣相色譜-質譜儀。
4.3 分析天平：感量為0.01g。
4.4 分析天平：感量為0.00001g。
4.5 容量瓶：10ml、100ml。
4.6 具塞刻度離心試管：10ml。
4.7 渦旋振盪器。
4.8 超聲波清洗儀。
4.9 離心機：轉速不小於5000r/min。
5 測定步驟
5.1 樣品處理
稱取1.0g（精確至0.01g）樣品於10ml容量瓶中，加入5ml甲醇（3.
1），渦旋振盪使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20min，冷卻至室溫後，用甲醇（3.1）稀釋至刻度，混勻後轉移至10ml刻度離心管中，以5000r/min離心5min。上清液經0.
45μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液備用。若樣品中6-甲基香豆素的濃度超過了線性範圍的上限，需對待測液進行適當稀釋。
5.2 色譜條件
a) 色譜柱：c18柱（ 250mm×4.6mm，5μm，以十八烷基矽烷鍵合矽膠為填充劑）；
b) 流動相：甲醇-磷酸二氫鈉緩衝溶液（3.4）；
梯度洗脫參考條件見下表：
注：梯度洗脫條件，操作者可根據樣品的不同選擇最佳條件，使6-甲基香豆素與其他組分峰獲得完全分離。
c) 流速：1ml/min；
d) 檢測波長：275nm；
e) 柱溫：35℃；
f) 進樣量：10l。
5.3 測定
按「5.2」項下色譜條件，取系列濃度的標準溶液（3.6）分別進樣，進行高效液相色譜分析，以系列標準溶液濃度為橫座標，峰面積為縱座標，進行線性回歸，建立標準曲線，得到回歸方程。
取「5.1」 項下樣品溶液進樣10μl，根據測定成分的峰面積，代入回歸方程計算6-甲基香豆素的濃度。按「6」項下計算公式計算樣品中6-甲基香豆素的含量。
6-甲基香豆素標準溶液高效液相色譜圖參見附錄a的圖a.1。
5.4 陽性結果確證
必要時，採用氣相色譜-質譜確證陽性檢測結果，以檢查化妝品中是否有其它物質干擾6-甲基香豆素的測定。如果檢出的色譜峰的保留時間與標準品一致，並且在扣除背景後的樣品質譜圖中，所選擇的離子均出現，且所選擇的離子的相對豐度比與標準物質相一致，則可判斷樣品中存在6-甲基香豆素。
氣相色譜-質譜（gc/ms）參考條件：
a) 色譜柱：hp-5ms 毛細管柱（30m×0.32mm×0.25m，5%-苯基-甲基聚矽氧烷）或相當者；
b) 柱溫程式：初始溫度100℃，保持3min，後以8℃/min 的速率公升至 200℃，保持 3min；
c) 進樣口溫度：250℃；
d) 介面溫度：280℃；
e) 載氣：氦氣1.0 ml/min；
f) 電離方式：ei；
g) 電離能量：70ev；
h) 監測方式：全掃瞄；
i) 監視離子範圍（m/z）：40~200；
j) 進樣方式：不分流進樣；
k) 進樣量：1.0l。
6-甲基香豆素的全掃瞄圖參見附錄c的圖c.1；質譜圖參見附錄c的圖c.2。
6 計算
式中：（6-甲基香豆素） —— 樣品中6-甲基香豆素的質量分數，%；
—— 從標準曲線中得出的測試溶液中6-甲基香豆素的質量濃度，μg/ml；
v —— 樣品定容體積， ml；
m —— 樣品取樣量，g。
7 **率
當樣品新增標準溶液濃度在0.001%～0.005%範圍內，測定結果的平均**率在92.2%～103.5%。
8 允許差
在重複條件下獲得的同一樣品溶液兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算術平均值的10%。
氣相色譜法
1 範圍
本方法規定了用氣相色譜法測定化妝品中6-甲基香豆素的含量。
本方法適用於膏霜、乳、液、粉類化妝品中6-甲基香豆素的測定。
暫無實驗資料表明本方式適用於蠟質類化妝品中6-甲基香豆素含量的測定。
2 方法提要
樣品在經過提取後，經氣相色譜儀分離，氫火焰離子化檢測器（fid）檢測，根據保留時間定性，峰面積定量，以標準曲線法計算含量。必要時，採用氣相色譜-質譜（gc/ms）進行確證。本方法對6-甲基香豆素的檢出限為0.
00013g，定量下限為0.0005g。若取1g樣品，本方法對6-甲基香豆素的檢出濃度為0.
00013%，最低定量濃度為0.0005%。
3 試劑和材料
除另有規定外，所用試劑均為分析純。
3.1 甲醇：色譜純。
3.2 無水硫酸鈉：於650℃灼燒4h，儲於密閉乾燥器中備用。
3.3 6-甲基香豆素：純度≥99.0%。
3.4 6-甲基香豆素標準儲備溶液[(6-甲基香豆素)=1.0g/l）]：
精密稱取6-甲基香豆素0.1000g於100 ml容量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度，即得標準儲備溶液（濃度為1g/l）。
3.5 系列濃度6-甲基香豆素標準溶液：精密量取標準儲備溶液（3.
5）5ml置於50ml量瓶中，即得100μg/ ml的標準溶液，再分別精密量取0.5 ml，1.0 ml，3.
0 ml，5.0 ml，10 ml於100ml的量瓶中，加甲醇溶解並稀釋至刻度。即得濃度分別為0.
5μg/ ml、1.0μg/ ml、3.0μg/ ml、5.
0μg/ ml、10.0μg/ ml的標準溶液。
4 儀器
4.1 氣相色譜儀：具氫火焰離子化檢測器（fid）。
4.2 分析天平：感量為0.01g。
4.3 分析天平：感量為0.00001g。
4.4 容量瓶：10ml、100ml。
4.5 具塞刻度離心試管：10ml。
4.6 渦旋振盪器。
4.7 超聲波清洗儀。
4.8 離心機：轉速不小於5000r/min。
4.9 注射式樣品過濾器（有機溶媒型，0.45μm）。
5 測定步驟
5.1 樣品處理
稱取1.0g（精確至0.01g）樣品於10ml容量瓶中，加入5ml甲醇（3.
1），渦旋振盪使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20min，冷卻放置室溫，用甲醇（3.1）稀釋至刻度，混勻後轉移至10ml刻度離心管中，以5000r/min離心5min。上清液經3g無水硫酸鈉（3.
2）脫水，經0.45μm濾膜過濾，濾液作為樣品溶液備用。若樣品中6-甲基香豆素的濃度超過了線性範圍的上限，需對待測液進行適當稀釋。
5.2 色譜條件
a) 色譜柱：hp-5 毛細管柱（30m×0.32mm×0.25m，5%-苯基-甲基聚矽氧烷）或相當者；
b) 柱溫程式：初始溫度100℃，保持3min，後以8℃/min 的速率公升至 200℃，保持 3min；
c) 進樣口溫度：250℃；
d) 檢測器溫度：280℃；
e) 載氣：氮氣1.0 ml/min（純度為99.999%）；
f) 燃氣：氫氣30 ml/min；
g) 助燃氣：空氣400 ml/min；
h) 尾吹n2流量：30 ml/min；
i) 進樣方式：不分流進樣；
j) 進樣量：1.0l。
注：載氣、空氣、氫氣流速隨儀器而異，操作者可根據儀器及色譜柱等差異，通過試驗選擇最佳操作條件，使6-甲基香豆素與其他組分峰獲得完全分離。
5.3 測定
按「5.2.1」項下色譜條件，取系列濃度的標準溶液（3.
5）分別進樣，進行氣相色譜分析，以系列標準溶液濃度為橫座標，峰面積為縱座標，進行線性回歸，建立標準曲線，得到回歸方程。取「5.1」 項下樣品溶液進樣1.
0μl，根據測定成分的峰面積，代入回歸方程計算6-甲基香豆素的濃度。按「6」項下計算公式計算樣品中6-甲基香豆素的含量。必要時用第一法佐證。
6-甲基香豆素標準溶液氣相色譜圖參見附錄a的圖a.1。
6 計算
式中：（6-甲基香豆素） —— 樣品中6-甲基香豆素的質量分數，%；
—— 從標準曲線中得出的測試溶液中6-甲基香豆素的質量濃度，μg/ml；
v —— 樣品定容體積， ml；
m —— 樣品取樣量，g。
7 **率
當樣品新增標準溶液濃度在0.001%～0.005%範圍內，測定結果的平均**率在96.3%～103.5%。
8 允許差
在重複條件下獲得的同一樣品溶液兩次獨立測定結果的絕對差值不應超過算術平均值的10%。
附錄 a
(資料性附錄)
液相色譜圖示例
圖a.1 6-甲基香豆素標準溶液的高效液相色譜圖
附錄 b
(資料性附錄)
氣相色譜圖示例
圖b.1 6-甲基香豆素標準溶液的氣相色譜圖
附錄 c
（資料性附錄）
gc/ms示例
圖c.1 6-甲基香豆素標準溶液的gc/ms全掃瞄圖
圖c.2 6-甲基香豆素標準溶液的gc/ms質譜圖
表c.1 6-甲基香豆素特徵離子表
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附件7 化妝品中苯氧異丙醇的檢測方法 1 範圍 本方法規定了採用液相色譜法測定化妝品中苯氧異丙醇 cas 770 35 4 含量的方法。本方法適用於淋洗類化妝品 包括乳液和水類，不包括口腔衛生用品 中苯氧異丙醇含量的測定。2 方法提要 樣品在經過提取後，經高效液相色譜儀分離，紫外檢測器檢測，根據保留...