生理指標測定方法 2

2021-08-01 07:17:03 字數 3105 閱讀 4776

1 葉綠素含量測定取樣0.2g左右,剪碎,放入黑色膠卷盒中加20ml等量丙酮乙醇混合液(0號調零管:20ml等量丙酮乙醇混合液),48h以後,待材料變白,取上清夜於440、645、663nm處測其od值。

計算:2 脯氨酸含量的測定

配藥:(1)3%磺基水楊酸溶液: 6g----200ml

(2)2.5%酸性茚三酮顯色液:冰乙酸和6mol/l磷酸經3:2混合,作為溶劑進行配製。

冰乙酸90ml

85%磷酸(15mol/l)  24ml用去離子水定溶至60ml

茚三酮3.75g

測定:(1)脯氨酸提取:取不同處理的剪碎葉片0.5g,分別置於大試管中,加入5ml%磺基水楊酸溶液,管口加蓋玻璃球,於沸水浴中浸提10min.

(2)取出試管,待冷卻至室溫後,吸取上清液2ml,加2ml冰乙酸和3ml顯色液(0號調零管:2ml冰乙酸+3ml顯色液+2ml去離子水),於沸水浴中加熱40min.

(3)取出冷卻後向各試管加入5ml甲笨充分振盪,以萃取紅色物質。靜置,待分層後吸取甲笨層,以0號管為對照在波長520nm下比色。

計算: 從標準曲線中查出測定液中脯氨酸濃度,按下式計算樣品中脯氨酸含量。

y = ( c * v ) / ( a * w )

式中:c――提取液中脯氨酸含量(由標準曲線求得),ug;

v――提取液總體積,ml

a――測定時所吸取的體積,ml;

w――樣品量,g;

y――脯氨酸含量(乾重或鮮重),ug/g.

sod,pod,mda酶和可溶性蛋白質的配藥:3個重複,

1 sod

1 ph7.8磷酸緩衝液:

(a)14.4gna2hpo4·12h2o溶於400ml水中取366ml;

(b)6.24gnah2po4·2h2o溶於400ml水中取34ml;兩液混成400ml,即為ph7.8磷酸緩衝液。

2 104 mmol/l 蛋氨酸(甲硫氨酸):稱取0.39g蛋氨酸,用蒸餾水定容至25ml容量瓶中

3 300 umol/l nbt(氮蘭四唑):稱取0.0125gnbt,用蒸餾水定容至50ml.

4 0.8mmol/l edta:稱取0.012mgedta,用蒸餾水定容至50ml容量瓶中

5 320um/l核黃素:稱取0.012g核黃素,用蒸餾水定容至100ml容量瓶中

反應液配藥用量

ph7.8磷酸緩衝液2ml         100ml

104 mmol/l 蛋氨酸(甲硫氨酸0.5ml25ml

300 umol/l nbt(氮蘭四唑1ml50ml

0.8mol/l edta0.5ml25ml

2 pod

1 ph7.0的10mmol/l磷酸緩衝液

(a) 稱取1.56g nah2po4·2h2o,定容於1000ml容量瓶中,取390ml.

(b) 稱取3.5g na2hpo4·12h2o定容於1000ml容量瓶中。取610ml.混合後即為1000ml ph7.0的磷酸緩衝液.

2 40mmol/lh2o2 0.3ml ------100ml 用蒸餾水配製

3 20mmol/l愈創木酚 0.1ml------50ml 用蒸餾水配製

4 20%三氯乙酸 10g------50ml 用蒸餾水配製

反應液配藥用量

(1) 磷酸緩衝液 (ph72.91ml291 ml

(2) 愈創木酚0.05ml5 ml

(3) 40mmol/lh2o20.02ml2 ml

3 mda

(1)10%三氯乙酸(tca)    10g------100ml

(2) 0.6%硫代巴比妥酸(tba)  先加少量的氫氧化鈉(1mol/l)溶解,再用10%的三氯乙酸定溶。

0.6g------5ml------95ml

4 可溶性蛋白質

考馬斯亮藍g-250: 稱0.1g考馬斯亮藍g-250,溶於50ml 90%乙醇中,加85%的磷酸中100ml,最後用蒸餾水定溶至1000ml,貯於棕色瓶中,此溶液常溫下可放置乙個月。

酶液製備:取洗淨的鮮材料0.5g置於冰浴的研缽中,先加2mlph7.

8的磷酸緩衝液,充分研磨至無粗纖維為止倒入離心管中,再用3ml(2+1)磷酸緩衝液洗淨研缽併入離心管,在10000轉離心20分鐘,上清液即為sod、pod粗提液。

1 sod 測定取4ml反應液,加入50ul的酶提取液再加50ul核黃素, 另作6支不加酶液的處理(用緩衝液代替)作為最大光化還原管(0號調零管:ph7.8的磷酸緩衝液),立即置於4000lx的螢光燈(光照培養箱全光照:

h1。溫度為室溫即可)下進行光還原反應,15分鐘後,用黑紙遮光,終止反應。並用0號調零管調零點,在560nm波長下比色測定od值。

按下式計算sod活性。

對照od值-樣品od值)*樣品體積

sod 活性=

對照od值*樣品鮮重*測定時樣品用量

2 pod測定取3ml反應液,加入20ul的酶提取液於小管中,充分混合後,在34c恆溫水浴中反應三分鐘。然後加20%三氯乙酸20ul,終止酶活性。以ph7.

0的磷酸緩衝液調零點,在470nm波長下測其光密度。

樣品od

pod的od值= *稀釋倍數

0.5g

3 mda測定取酶液2ml加2ml0.6%的tba於試管中(0號調零管:2ml+2mltba),搖勻後沸水浴中加熱15min,冷卻後,4000轉/分鐘,離心10min.

取上清液於532、600、450nm處測其od值,以0號調零管調零。

mda濃度=6.45*(od532-od600)-0.56*od450(μmol·l-1)

mda含量=mda濃度*提取液體積(5ml)/鮮重(0.5g)(μmol/g fw)

4 可溶性蛋白質測定取酶液1ml加5ml考馬斯亮藍g-250於試管中(0號調零管:5ml考馬斯亮藍g-250+1mlph7.8的磷酸緩衝液),充分混合,放置 15min,.

取上清液於於593nm處測其od值,以5ml考馬斯亮藍g-250+1mlph7.8的磷酸緩衝液調零。

計算:樣品中蛋白質含量(mg/g)=(c*vt)/(v1*fw*1000)

c=查標準曲線的蛋白質含量

vt=提取液總體積(ml)(原始提取液)

fw=樣品鮮重(g)

v1=測定時加樣量(ml)(原始提取液)

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