細胞轉殖化培養技術—有限稀釋法
一、實驗目的：
1、掌握用有限稀釋法進行細胞轉殖化培養技術；
2、學會細胞轉殖形成的辯觀察技能；
3、配合抗體分泌細胞篩選技術，確定抗體分泌細胞。
二、實驗原理：
轉殖化培養即單細胞培養技術，用有限稀釋法進行雜交瘤細胞轉殖化培養，可以及時確定陽性雜交瘤細胞株，同時淘汰因發生染色體丟失或抗體的輕、重鏈基因分離而出現無抗體分泌陰性細胞株。
一般雜交瘤細胞需經過52—3次反覆轉殖後，才能達到100%細胞陽性率。
該辦法亦適用於一般細胞培養中的細胞純化、突變細胞株的選擇，識別和分離。是細胞株的常用方法。
三、實驗材料：
雜交瘤細胞、25毫公升培養瓶、96孔細胞培養板（天津有機玻璃廠）、移液管（1毫公升、5毫公升、10毫公升）、彎頭滴管、倒置顯微鏡、co2培養箱、白細胞計數板、計數器、蓋玻片、防水筆、rpmi-1640、小牛血清、青鏈黴素、10毫公升刻度離心管，00橡膠塞，飼養細胞（3-6×105/ml、見腹腔細胞的製備）。
四、實驗步驟：
1、分裝了每孔0.1毫公升腹腔細胞的96孔細胞培養板（可提前24小時準備就緒，置co2培養箱中備用）；
2、自細胞培養瓶中收集長勢良好的雜交瘤細胞（亦可自24孔培養板孔中收集），製成懸液。
3、按白細胞計數方法準確計得細胞懸液的細胞數，一般在105/毫公升左右。
4、取3支10毫公升刻度離心管排列在超淨工作台試管架上，先用無血清培養基將細胞稀釋至103/毫公升，再用含15%小牛血清的完全培養基稀釋到101/毫公升細胞，即每0.1毫公升1個細胞。
5、每孔0.1毫公升細胞懸液。
6、置37℃5%co2培養箱，4天後取出觀察，並在板蓋上打上標記，做好記錄並統計結果。
7、繼續培養時，則在第4-5天更換1/2培養基，約第7-9天可以收穫培養液上清用於檢測抗體。並重複檢測1-2次。
8、選擇單轉殖生長孔，生長良好，陽性強者，轉移到24孔板再做轉殖經培養或擴大培養。
五、實驗結果：
實驗結果以總細胞孔（如96孔）**現轉殖孔統計出轉殖百分率，並可進一步按單細胞孔、雙細胞孔、多細胞孔分別計算出百分率。
六、注意事項：
1、注意無菌操作，一旦發現汙染（孔）必須及時處理；
2、計數細胞要求準確，稀釋量亦要準確，否則將造成一孔多細胞轉殖或轉殖百分離太低；
3、在計數轉殖出現率之前，不宜更換培養液，也不宜強烈振動培養板；
4、做轉殖化培養的小牛血清必須是優質血清；
5、若做轉殖抗體檢測時，特別要保護細胞的生長狀況，防止細胞生長不良甚至丟失。
七、說明：
哺乳動物細胞通過分離、稀釋接種，培養在適宜於單細胞生長的培養液中，形成細胞轉殖。運用這項技術可以製作細胞成活曲線，即在接種相同數量細胞的培養瓶中，加入不同濃度的化學藥品，或照以不同劑量的射線，觀察其對細胞的聽見害程度。由此可以在哺乳類細胞中進行誘變試驗及分離突變細胞。
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