新無標記基因敲除系統的構建原理是：
引入分枝桿菌噬菌體高效同源重組蛋白che9c60和61，以加強分枝桿菌發生同源重組的能力；
引入xer剪下重組系統，用於切除抗性標記基因，以實現無抗性基因引入；
che9c60、61蛋白在提高分枝桿菌的同源重組效率的同時會毒害分枝桿菌的生長，為此我們設計了條件可控表達系統——四環素誘導可控表達系統。
xer剪下重組系統的工作機理是：
分枝桿菌自身具有的xer內源重組酶能夠識別28bp的dif位點，並切除其包含的基因，將抗性基因兩端連線上dif序列，即可用於切除抗性標記基因。
四環素誘導可控表達系統的工作機理是：
使che9c60、61蛋白表達受teto啟動子控制，在未加誘導劑時teto啟動子受tetr阻遏蛋白抑制，從而阻止che9c60、61蛋白的表達，降低che9c60、61蛋白對菌體毒害，當加入誘導劑——脫水四環素，tetr阻遏蛋白則結合四環素分子，tetr從teto啟動子上脫落，從而使重組蛋白gp60和gp61得到表達。
為了工作方便起見，我們採用二元質粒體系，pfq作為helper質粒用於條件表達che9c60、61蛋白，pfq-xer則用於基因打靶和抗生刪除。
6.3實驗方法
6.3.1提高同源重組效率的pfq質粒構建
質粒pfq構建流程如圖6.1所示。
6.3.1.1 pimyc-tetr阻遏蛋白和che9c gp60-61重組蛋白基因釣取
依據6.2.6所設計的引物，運用pcr分別擴增出pimyc-tetr和che9c gp60-61目的基因。目的基因結構示意圖6.2所示。
6.3.1.2 pfq質粒的構建
參照圖6.1的pfq質粒構建流程圖，依次pimyc-tetr、che9c gp60-61和psel00質粒進行扣應醜切、純化、連線、轉化dh5a大腸杆謝驗證等分子生物學操作，將它們依次整合，完成對pfq質粒的構建。pse100質粒線性結構如圖6.
3所示，完整的pfq質粒如圖6.4。
6.3.2.1 dif+kan抗性基因和hsp60啟動子基因的釣取
依據6.2.6所設計的引物，運用pcr分別擴增出dif+kan和hsp60啟動子目的基因。基因結構示意圖如下：
參照圖6.1的pfq質粒構逮流程圖，將dif+kan、hsp60啟動子進行相應酶切、純化、連線、轉化dh5a大腸桿菌驗證等分子生物學操作，將它們連線整合，完成對pfq-xer質粒的構建。pfq-xer質粒如圖6.
4。6.3.3同源組片段的構建同源重組片段構建流程如圖6.8所示。
6.3.3.1 kstr3同源臂構建於 puc-19t載體上
首先先將上游同源臂kstr3-up和下游同源臂kstr3-down分別插入至puc-19t通用質粒載體上，獲得kstr3-up+puc-19t和kstr3-down+puc-19t重組質粒並完成電泳驗證和測序驗證。而後，選用pstl和hindⅲ雙酶切上述獲得的重組質粒，酶切產物純化後，利用fermentas t4 ligase進行連線，獲得構建於puc-19t載體上的同源片段的上下游基因片段，如圖6.9。
6.3.3.2 kstr3同源重組片段構建
參照圖6.8的同源重組片段構建流程示意圖，將dif+kan、hsp60啟動子進行相應酶切、純化、連線、轉化dh5a大腸桿菌驗證等分子生物學操作，將它們連線整合，完成對攜帶kstr3同源重組基因片段的kstr3-puc-19t重組質粒的構建並進行酶切驗證。選用saci和hindⅲ對上述驗證正確的重組質粒進行酶切，酶切液採用1%瓊脂糖凝膠電泳分離後，獲得kstr3同源重組基因片段懸液。
kstr3同源重組基因片段如圖6. 10。
6.3.4無標記敲除系統的構建與驗證
無標記基因敲除系統的構建與驗證方案如圖6.1丨所示。6.
3.4.1構建pfq-ms工程菌預先製備分枝桿菌ms感受態（見第三章），提取驗證正確的電轉質粒pfq，借助micropulser電轉化儀將pfq質粒電轉化匯入新金分枝桿菌ms中，並利用潮黴素抗性進行篩選，獲得攜帶ppfq質粒的pfq-ms工程菌。
（具體電轉化操作方法見第三章）
6.3.4.2 kstr3同源交換重組工程歯蹄選
將6.3.3.
2構建獲得的kstr3同源重組基片段，參照第三章採取電轉化方式入pfq-ms工程歯感受態，進行kstr3基因的同源重組交換。採用kanamycin抗性對kstr3 同源交換重組成功的工程閒進行篩選，獲得kstr3基因刪除，插入攜帶kanamycin抗性的目的工程菌。最後運用pcr擴增目的基因kstr3，進行1%瓊胎糖凝膠電泳初步驗證和測序驗證序列比對。
6.3.4.3 kanamycin抗性刪除的工程萌蹄選
kanamycin抗性刪除的工程菌篩選，我們採用無抗性培養，在實驗設計的xer剪下重組系統的作用下，以自然丟失的方式進行。6.3.
4.2獲得的成功進行同源交換的工程菌，首先進行2-3輪的無抗性傳代培養，而後稀釋塗佈無抗性lb平板培養。最後，在之前無抗性.
lb板上生長的單菌落中選取若干，標記對應轉移至kanamycin抗性的lb板上劃線培養分析。若單菌落僅能在無抗性的lb板上生長，則為目的菌株，即：獲得成功進行無抗性標記的kstr3基因刪除菌。
參照如圖6.12。
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