謝雲飛生科院醫用生物學教研室 3831928
一、實驗目的
1．掌握細胞凍存與復甦的原理。
2．熟悉體外培養細胞液氮凍存技術及凍存細胞的復甦技術。
3．掌握細胞計數的一般方法。
4. 掌握離心機的使用方法
二、實驗原理
在不加任何保護劑的條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發生機械損傷、電解質公升高、滲透壓改變等，引起細胞死亡。向培養液中加入保護劑可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。
貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
目前細胞凍存多採用二甲基亞碸（dmso）或甘油作保護劑，這兩種物質分子量小，溶解度大，易穿透細胞，能提高細胞膜對水的通透性。
復甦細胞採用快速融化的方法，使細胞迅速通過細胞最易受損的－50～0℃，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化。
細胞凍存及復甦的基本原則是「慢凍快融」。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃／min，當溫度低於-25℃時可加速，到-80℃之後可直接投入液氮內(-196℃)。復甦細胞時則直接將裝有細胞的凍存管投入37-39℃熱水中迅速解凍。
三、實驗步驟
（一）凍存
1．將1 ml雞血細胞懸液（1%）轉移至離心管中，加入7 ml生理鹽水。
2．1000rpm離心5 min，棄上清液。
3．向沉澱中加1 ml凍存液，重懸。
4．將懸液轉入凍存管中，將凍存管口封嚴。
5．將凍存管裝入吊桶，用兩層紗布封口，懸吊於液氮罐口內的氣態氮中放置20min，然後浸入液氮（-196℃）中。
（二）復甦
1.準備37℃的水浴箱。
2.從液氮中取出吊桶，迅速將凍存管倒入37℃溫水中並不斷攪動，使凍存管中的凍存物在1 min之內融化。
3.將細胞懸液轉移到離心管中，並加入5 ml培養液。
4.1000rpm離心5 min，棄上清液。
5.沉澱2 ml培養液，吹打均勻。
（三）染色和計數
1.染色：用滴管吸取0.5ml細胞懸液放入乾淨試管中，再加0.4％台盼藍染液0.5ml，用吸管輕輕吹打混勻，染色2min。
時間不能延長，否則活細胞也被染上色
2.計數：用記數板計算細胞活力。
（四）細胞活力測定實驗操作
1.熟悉計數板：計數板有前後兩個計數室（見下圖1），計數室與蓋玻片的距離為0.
1mm，每個計數室分九大格，各格邊長為1mm，四角的大格被劃分為16個中方格，用於白細胞計數及組織培養的細胞計數；**的大格劃分為25個中方格，每個中方格又被劃分為16個小格，用於紅細胞和血小板計數（見下圖2）。用酒精棉球輕輕擦拭計數板的計數室面，晾乾後蓋上蓋玻片於計數室上，用低倍鏡觀察計數板。
圖1. 血細胞計數板平面圖圖2. 計數室的分格
2.滴片：將擦乾淨的計數板放回實驗台面上，用吸管吸取試管中已染色的細胞懸液（注意吸前混勻），滴在計數板上蓋玻片邊緣，讓細胞懸液自然流入計數室內（注意滴加的量不要過多或過少，計數室內不應有氣泡存在），靜置2min。
3.計數：將計數板放到載物台上，在低倍鏡下按一定方向（如順時針）逐格數出計數室四角的每個大格內的活、死細胞個數。若細胞正好壓在格線上，則按數上不數下、數左不數右的原則計數。
活細胞：較大，橢圓形，透明，有核；
死細胞：較小，圓形，藍色。
4.計算：
如計細胞總數則按下式求出細胞密度。
四大格的細胞總數
細胞密度（個/ml10000×稀釋倍數
4注：1 ml＝1000 mm3，每大格的體積為0.1mm3，故式中乘以10000便等於每毫公升懸液中的細胞數。
如計算細胞活力則按下式求出細胞活力
四大格的活細胞總數
細胞活力100﹪
四大格的細胞總數
四、注意事項
1．要做好凍存記錄（如細胞名稱、日期、罐中位置等）。
2．操作時應戴手套，以免**接觸液氮而凍傷。
3. 使用血球計數板時光線不能太亮
五、作業（1和2）與思考
1.簡述細胞凍存與復甦的原理
2.每組同學復甦一管凍存細胞，計算細胞活力，如活力較低，試分析可能的原因。
3.凍存細胞時有哪些注意事項？
4.凍存細胞的復甦有哪些操作要領？
5.試述台盼藍染色法鑑別死活細胞的原理，並分析染色時間過長時本來是活細胞也被染上色的原因。
細胞凍存與細胞復甦標準操作規程 SOP
背景知識 細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具 培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特性都將逐漸發生變化並隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在 70 冰箱中可以儲存一年之久 細胞儲...
細胞凍存和復甦標準操作規程 SOP
背景知識 細胞培養的傳代及日常維持過程中，在培養器具 培養液及各種準備工作方面都需大量的耗費，而且細胞一旦離開活體開始原代培養，它的各種生物特 都將逐漸發生變化並隨著傳代次數的增加和體外環境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進行細胞凍存十分必要。細胞冷凍儲存在 70 冰箱中可以儲存一年之久 細胞儲...
藥學基礎實驗細胞與免疫學技術實驗部分思考題
以計數酵母菌為例 1 用血球計數板計數酵母菌懸液的酵母菌個數.2 樣品稀釋的目的是便於酵母菌懸液的計數,以每小方格內含有4 5個酵母細胞為宜,一般稀釋10倍即可.3 將血球計數板用擦鏡紙擦淨,在 的計數室上加蓋專用的厚玻片.4 將稀釋後的酵母菌懸液,用吸管吸取一滴置於蓋玻片的邊緣,使菌液緩緩滲入,多...