本研究報告主要介紹從三個不同品種的刀豆當中提取脲酶的工藝流程並且確立了酶活性的檢測方法。通過固體浸提、乙醇分級沉澱、g-200葡聚醣凝膠過濾、冷凍乾燥等工藝處理，最終獲得比活性分別為923.6u/g，780.
1u/g，585.3u/g的脲酶。
1 刀豆脲酶的提取工藝
1.1 30%乙醇提取刀豆脲酶
用天平稱取乾燥的刀豆，粉碎，以100目鋼篩篩出豆粉。向錐形瓶中加入10.0g豆粉，再加入100ml（固液比1：
10）的30%乙醇溶液，充分搖勻30min，放置冰箱儲存24h後，以4000r/min離心15min，上清液為脲酶粗提取液。
1.2 刀豆脲酶的分離純化
1.2.1 乙醇分級沉澱
向粗酶液中加入預冷（-20℃）的無水乙醇至終體積分數為10%，以8000r/min冷凍離心10min進行一級沉澱，收集上清液；再向上清液中加入預冷無水乙醇至終體積分數為40%，以15000r/min冷凍離心10min，棄去上清液，收集沉澱，立即將沉澱溶於少量磷酸緩衝液（ph6.8）中，4℃儲存備用。
1.2.2 凝膠過濾
脲酶分子量較大，脲酶粗製品通過交聯葡聚醣 senhadex g－200 層析柱，酶本身不能進入凝膠顆粒，而其他小分子物質及分子量較小的蛋白質可擴散進入凝膠顆粒。用磷酸緩衝液（ph=6.8）作為洗脫劑，分子量大的脲酶首先被洗脫下來，從而達到與其他物質分離的目的。
首先進行凝膠溶脹，然後裝柱，加樣，控制流速，流出的液體分別收集在刻度離心管中，收集量為 3 ml/管。或者在裝置允許的情況下，直接使用蛋白質自動純化系統進行蛋白質純化，本實驗採用此種方法。通過凝膠過濾，收集蛋白質含量較高的各管並4℃保藏備用。
1.2.3 冷凍乾燥
將經凝膠過濾後的酶液分裝在能夠保證蒸發表面盡量大且厚度盡量薄的容器中，裝量要均勻，然後進行冷凍處理，凍結之後放入冷凍乾燥機進行冷凍乾燥。乾燥完畢後立即對樣品進行酶活性檢測，同時將產品低溫保藏。
1.3 工藝流程圖
2 刀豆脲酶活性檢測方法
2.1 原理與方法
2.1.1 基本原理
脲酶在一定條件下，可水解尿素生成銨，在鹼性條件下，銨鹽轉化成氨，其與納氏試劑反應生成棕黃色絡合物，其色度與脲酶活性成正比。反應方程式如下：
co(nh2)2+2h2onh4)2co3
(nh4)2co3+2naohna2co3+2nh3+2h2o
2k2(hgi4)+3koh+nh3nh2hg2oi↓（黃棕色沉澱）+7ki+2h2o
在37℃時，1ml酶液每分鐘催化產生1μg分子氨的酶量為1個酶活力單位。
2.1.2 主要儀器及試劑
（1）儀器：722型可見光分光光度計，上海精密科學儀器****製造。數顯電子恆溫水浴鍋，常州國華電器****產。pl203電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）****產。
（2）硫酸銨標準貯存液：精確稱取(nh4)2so4 0.9910g（60℃乾燥至恒量重）加蒸餾水溶解後轉入1000ml容量瓶中，定容至刻度，此溶液為1ml≈15μmol的nh4+。
硫酸銨標準應用液：精確吸取10ml貯存液，置入100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度，此溶液1ml≈1.5μmol的nh4+。
3%尿素緩衝液（ph7.0±0.1）：
稱取24.354g磷酸氫二鈉（na2hpo4·12h2o），9.254g磷酸二氫鉀（kh2po4）溶於水並稀釋至100ml，再將3g尿素溶在此緩衝液中，有效期1個月。
30%三氯乙酸：稱取30g三氯乙酸加蒸餾水至100ml。納氏試劑：
稱取16g氫氧化鈉，溶於50ml無氨水中，充分冷卻至室溫；另稱取10g碘化汞和7g碘化鉀溶於水，然後將該溶液在充分攪拌的條件下緩慢注入上述的氫氧化鈉溶液中，並用無氨水稀釋至100ml，貯於聚乙烯塑料瓶中，常溫避光儲存。
2.2 結果
2.2.1 硫酸銨標準曲線
按表1進行操作，然後用722型可見光分光光度計比色，用蒸餾水調0，測其吸光度a（λ=480nm）。以硫酸銨標準液（μmol數）為橫座標，吸光度為縱座標繪製標準曲線。y=0.
1235x-0.0047,r2=0.9978。
表1 硫酸銨標準曲線製作操作步驟
2.2.2 樣品處理
稱取0.020g脲酶樣品，加1ml蒸餾水，充分溶解。
2.2.3 樣品測定
將上述酶溶液按1:2稀釋（若酶活性較高，可適當增大稀釋倍數），按表2操作。
表2 酶活性檢測操作步驟
2.2.4 結果計算
脲酶活性（活性單位）=*酶溶液稀釋倍數
a：為經標準曲線所查得的樣品管中nh4+的μmol數。
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