植物組織培養的一些注意事項
一、常用培養基主要特性
1、高鹽成分培養基包括ms、ls、bl、bm、er 等培養基。其中ms 培養基應用最廣泛,其鉀鹽、銨鹽及硝酸鹽含量均較高, 微量元素種類齊全, 其養分數量及比例均比較合適, 廣泛用於植物的器官、花藥、細胞及原生質體的培養。ls、bm、er 培養基由ms 培養基演變而來。
2 、硝酸鉀含量較高的培養基包括b5 、n6 、lh、gs 等培養基。
①b5 培養基b5 培養基除含有較高的鉀鹽外, 還含有較低的銨態氮和較高的鹽酸硫胺素, 較適合南洋杉、葡萄及豆科與十字花科植物等的培養。
②n6 培養基n6 培養基( 朱至清等1975 ) 系我國學者創造, 獲國家發明二等獎, 適用於單子葉植物花藥培養, 柑橘花藥培養也適合, 在楸樹、針葉樹等的組織培養中使用效果也好。
③sh 培養基是礦鹽濃度較高的一種培養基, 其中銨與磷酸是由磷酸二氫銨
( nh4 h2 po4 ) 提供的, 這種培養基適合於某些單子葉及雙子葉植物的培養。
3 、中等無機鹽含量的培養基
①h 培養基本培養基大量元素約為ms 培養基的一半, 僅磷酸二氫鉀及氯化鈣稍低, 微量元素種類減少, 而含量較ms 為高, 維生素種模擬ms 多。適於花藥培養。
②尼奇培養基(niotsch 1969 ) 此培養基與h 培養基成分基本相同, 僅生物素比h 培養基高10 倍。也適合於花藥培養。
③公尺勒培養基(miller 1963 ) 此培養基和blaydes(1966) 培養基二者成分完全相同。適合大豆愈傷組織培養和花藥等培養用。
4 、低無機鹽培養基大多情況下用於生根培養基。有以下幾種:
①改良懷特培養基(white 1963 )
②ws 培養基(wolter & skoog 1966)
③克諾普液( knop 1965 ) 花卉培養上用得多。
④貝爾什勞特液(berthelot 1934)
⑤hb 培養基( holley & baker 1963) 此培養基在花卉脫毒培養和木本植物的莖尖培養中效果良好。其成分是大量元素比1/ 2 克諾普( knop ) 液稍多, 微量元素用貝爾什勞特液, 每公升培養基中加0 . 5ml。
二、與培養基有關的一些細節問題
1、培養基所用藥品應採用等級較高的化學純cp(**) 及分極純ar(二級) , 以免雜質對培養物造成不利影響。
2、調節ph也可用精密ph試紙(應在乾燥器中儲存, 以免吸濕而失效)。培養基過酸的可用1mol/ l 氫氧化鈉( naoh) 來調節; 培養基過鹼的可用1mol/ l 鹽酸( hcl ) 來調節( 1mol/ l naoh 的配製方法是稱40gnaoh, 溶解後加入蒸餾水, 定容到1 000ml 即可。1mol/ l hcl 的配製方法是量取12mol/ l hcl 84ml , 加水定容至1 000ml)。
經高壓蒸汽滅菌後, 由於某些成分的分解(如蔗糖的分解) 或氧化, 酸度會增加( ph 值一般可降低0 . 2 )。有時玻璃器皿質量較差, 其中一部分物質溶解, 也會影響酸度的變化。
這些在調整ph 值時都要考慮進去。分裝後應立即滅菌, 若因故不能及時滅菌, 最好放入冰箱中在24h 內完成滅菌工作。滅菌時壓力表讀數為0 .
8kg/ cm2 ～1 . 1kg/ cm2 , 121℃時保持15min～20min 即可。
3、某些生長調節物質, 如吲哚乙酸、玉公尺素及某些維生素等物質遇熱不穩定, 因此不能進行高壓滅菌, 而需用過濾方法滅菌, 經過濾滅菌的溶液, 可在瓊脂培養基溫度下降到大約40℃時加入到已高壓滅菌的培養基中。
4、配好的培養基可放到培養室中預培養3d ,若沒有汙染反應, 則證明是可靠的, 可以使用。暫時不用的培養基最好置於10℃下儲存, 含有生長調節物質的培養基在4℃～5℃低溫下儲存則更理想。含吲哚乙酸或赤霉素的培養基應在配製一周內用完, 其他培養基至多也不能超過乙個月。
一般情況下, 兩周內應用完, 以免幹
燥變質。
三、培養材料及消毒
1、取材季節的影響：大多數植物應在其生長開始的季節取樣, 生長末期或已進入休眠期, 則外植體對誘導反應遲鈍或無反應。
2、器官的生理狀態和發育年齡：沿植物的主軸, 越向上的部分所形成的器官其生長的時間越短, 其生理年齡也越老, 越接近發育上的成熟, 越易形成花器官。反之, 越向下, 其生理年齡越小。
木本植物的組織培養中, 以幼齡樹的春梢嫩枝段或基部的萌條較好, 下胚軸與具有3 對～4 對真葉的嫩莖段, 生長效果也較好 。一般情況下, 幼年組織比老年組織具有較高的形態發生能力。
3、材料大小的影響：材料越小成活率越低, 莖尖培養存活的臨界大小應為乙個莖尖分生組織帶1 個～2 個葉原基, 約0 .2mm～0 .
3mm 大小。葉片、花瓣等約為5mm2 , 莖段則長約0 .5mm。
因此, 除非用於去除病毒否則不宜將外植體切的過小。但並不是說外植體越大越好, 外植體過大易造成汙染, 有實驗證明外植體越大汙染率越高。
4、材料的滅菌：一般是組織越大越易汙染, 夏季比冬季帶菌多，甚至不同年份汙染的情況也有區別。取材最好選在中午或下午, 避開陰雨天取材可減少汙染率。
消毒是為了消滅病菌, 以保證無菌組織培養的進行。但不同植物及一株植物不同部位的組織, 其帶菌程度不同, 它們對不同種類、不同濃度的消毒劑的敏感度也不一樣。最初所使用的消毒劑種類, 濃度及消毒時間的長短都要進行摸索, 以達到最佳的消毒效果。
材料有絨毛最好在消毒液中加入幾滴吐溫- 80 ,對與難消毒的根及地下部位材料可將其浸入消毒液中進行抽氣減壓, 以幫助消毒液的滲入, 從而達到徹底滅菌的目的。潘學峰等( 1998) 報道, 12% 的雙氧水+ 0 .1%的公升汞混合液對南方地下莖生薑滅菌10min 的效果最好。
四、材料的接種
1、接種室的消毒：植物組織培養技術實際上是一種無菌操作和無菌培養技術, 做好接種室的消毒是至關重要的。汙染的主要**是空氣中的細菌和真菌孢子, 因此, 每次接種前應進行地面的清潔衛生工作, 並用70%酒精噴霧使空氣的灰塵沉降, 並用紫外線燈照射20min。
接種前超淨工作檯面要用新潔爾滅或酒精擦洗,並定期清洗過濾膜, 以延長使用壽命。
2、 無菌操作要求：工作人員使用的工作服、帽子、口罩等, 要經常保持乾淨, 並定期進行消毒, 即將洗淨、晾乾的衣帽、口罩等用紙包好後與培養基一起進行高壓滅菌。工作人員的頭髮、衣服、手指中都帶有許多雜菌, 為此要穿上工作服, 戴上帽子, 也必須剪除指甲, 並用肥皂擦洗, 最好再在新潔爾滅溶液中浸泡10
min , 接種操作前則用70%酒精擦洗。工作人員的呼吸所產生的汙染, 主要是
在接種時談話或咳嗽所引起的, 因此, 在操作時應禁止談話並應戴上口罩。
3、材料的分離、切取和接種
切割動作要快, 防止擠壓使材料受損傷而招致培養失敗, 也要避免使用生鏽的刀片, 以防止氧化現象產生。接種時要防止交叉汙染的發生,刀和鑷子等接種工具使用一次應放入70% ( 或95%)酒精中浸泡, 然後灼燒放涼備用。
接種時輕輕取下封口紙, 動作要慢以免氣流衝入瓶中造成汙染。將瓶口靠近酒精燈火焰, 瓶口傾斜, 以免空氣中的微生物落入瓶中,將瓶口外部在燈焰上燎數秒鐘, 將灰塵雜物等固定在原處, 然後用鑷子將外植體送入瓶中, 材料在培養容器內的分布要均勻, 以保證必要的營養面積和光照條件。莖尖、莖段等基部插入固體培養基中, 葉片通常將葉背接觸培養基, 這是由於葉背氣孔多, 利於吸收水分和養分的緣故。
五、材料的初代培養
1、實驗方案的設計
1）、單因子實驗設計：單因子實驗是組織培養中最常用的實驗方法, 尤其在選擇適當的激素種類和濃度配比上使用最多。
2 ）、正交實驗設計植物離體培養的成功是由多種因素決定的。正交設計是多因素分析的有力工具, 它可以很方便的從眾多因素中選出主要影響因素及最佳水平, 因為它可以用較少的實驗次數得到較多的資訊。例如, 乙個7 因素水平的實驗, 若將各因素水平全部組合都做一遍, 需要27 = 128 次, 而正交設計只需做8 次實驗就可以了, 雖然實驗次數減少了, 但因為各因素水平搭配均勻, 8 次實驗基本代表了全部實驗的情況。
正交實驗的設計, 主要工具是正交表。大多數生物統計學書都列出了可供選擇的正交表,如l4 ( 23 ) , l8 (27 )見(表2 - 11 , 表2 - 12) 。字母l 右下角號碼8 表示它有8 個實驗要做, 括號內的指數7 表示這張表所安排的實驗最多可考察7 個因素(也可安排2 個～6 個, 超過7 個要選擇其他正交表) , 底數2 表示被考察的因素只要求兩個水平。
在進行實驗前可根據要測試因素的多少及每種因素所考察的水平, 選擇適合的正交表, 然後按表進行實驗。現舉乙個例子來說明, 設影響某種植物試管苗生長的因素有光照時間、光照強度、ph 值、溫度、蔗糖濃度、ba濃度、naa 濃度7 個因素, 每個因素選擇兩個水平, 即, 光照時間( 10h , 14h )、光照強度(1000lx , 2000lx )、ph 值( 5 . 5 , 5 .
8 )、溫度( 20℃ , 25℃) 、ba 濃度( 0 . 5 , 2 . 0 )、naa 濃度( 0 .
5 ,1 . 0)、蔗糖濃度(2% , 4%)。現根據因素和水平的多少選擇乙個適合本實驗的正交表, 選l8 (27)最理想, 填表時, 因素水平對號入座, 見表( 2 - 13 )。
第一號實驗是光照時間10h/ d、光照強度1000lx、ph 值5 . 5、ba 濃度2 . 0、naa 濃度0 .
5、蔗糖濃度4% , 其他實驗依次類推。根據8 個實驗結果, 如出苗數量、苗高、生根數、移栽成活率等, 綜合考慮, 根據需要選取各最適培養條件。也可通過一定的計算方法(參考統計學書) , 算出極差( r) , 極差(r) 表示每個因素在實驗中所起作用的大小, r 越大表示該因素的不同水平對實驗結果的影響越大, 但若沒有可計算的指標時, 還是選擇單因子實驗較好。
2、初代培養物的建立
1）、保證無菌
2）、條件合適：首先, 一定要選擇好合適的作物種類、品種及培養的部位; 其次,一定要選擇合適的培養基, 激素及其他新增物; 還要注意掌握適宜的環境條件。所以在進行一種植物的組織培養之前, 應查詢該種植物有關方面的資料, 根據這種植物過去所採用的培養部位、培養基、培養條件和培養技術等, 再決定自己的工作步驟。
植物組培實驗室配置清單
植物組培實驗室建設 目錄1 功能簡述 1 1 準備室 1 2 滅菌室 1 3 緩衝間 2 4 無菌操作室 2 5 培養室 2 6 馴化室 3 7 溫室 3 8 輔助實驗室 非必要 3 細胞學實驗室 3 生理生化分析室 4 2 裝置及耗材清單 4 1 試驗裝置清單 4 2 常備試劑清單 6 ms培養基...
組培實習報告
工廠化育苗課程實習報告 學院園藝學院 專業年級園藝 2008 學號080318116 姓名林琳琳 指導老師 林玉玲賴鐘雄 一 實習目的 通過實習參觀植物工廠化生產車間，了解植物工廠化生產所需裝置和實驗室設施，了解和掌握試管苗工廠設計方法，掌握瓶苗的培養與瓶苗培育成商品苗的技術要領。此外，通過實踐，了...
組培實驗方案
摘要驅蚊草又叫淨蚊香草，是將來自澳洲的天竺葵植物細胞與中國的一種含有香茅醛物質的植物細胞融合而成的，它為多年生草本植物，無花，四季不落葉。葉片自然散發出帶有香茅醛的檸檬香味的氣體，具有良好的驅避蚊蟲 淨化空氣的作用 且其對人體無任何不良影響，還可提神醒腦 緩解壓力，是一種理想的環保產品。其主莖比較柔...