總大腸菌群（濾膜法）
1、 適用範圍
生活飲用水、水源水
2、 儀器
高溫蒸汽滅菌器、濾器、口徑0.45μm濾膜、培養箱、冰箱、天平、無齒鑷子、直徑9cm平皿、滅菌試管、滅菌吸管、酒精燈、燒杯、量筒、1000ml容量瓶。
3、 步驟
(1) 儲備培養基的製備
品紅亞硫酸鈉培養基：
加入蛋白腖10g、酵母浸膏5 g、牛肉膏5 g、乳糖10 g、瓊脂20 g、磷酸氫二鉀3.5 g、無水亞硫酸鈉5 g、鹼性品紅乙醇溶液（50g/l）20ml、蒸餾水1000ml。
配製方法：
先將瓊脂加到500ml蒸餾水中，煮沸溶解（用大燒杯），於另500ml蒸餾水中加入磷酸氫二鉀、蛋白腖、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補足蒸餾水至1000ml，混勻後調ph值為7.2～7.4，再加入乳糖，分裝，68.
95kpa（115℃，10lb）高壓滅菌20min，儲備於冷暗處備用。（建議培養基用多少配多少）
乳糖蛋白腖培養基
蛋白腖10g，牛肉膏3g，乳糖5g，氯化鈉5g，1.6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，蒸餾水1000ml。
配製方法：
將蛋白腖、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解於1000ml蒸餾水中，調節ph為7.2-7.4，再加入1.
6%溴甲酚紫乙醇溶液1ml，充分混勻，分裝於含有倒置的小玻璃管的試管中，於高壓蒸汽滅菌鍋中，在115℃滅菌20min，貯存於暗處備用。
(2) 平皿培養基的製備
將上面製備好的備用的培養基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的50g/l的鹼性品紅乙醇溶液置於滅菌空試管中，再按比例稱取所需的無水亞硫酸鈉置於另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解後，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。
用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加於鹼性品紅乙醇溶液至深紅色褪成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與鹼性品紅的混合液全部加到已融化的儲備培養基內，並充分混勻（防止產生氣泡）立即將此種培養基15ml傾入已滅菌的空平皿內。待冷卻凝固後置冰箱內備用。此種已製成的培養基於冰箱內儲存不宜超過兩周。
如培養基已由淡粉色變成深紅色，則不能再用。
(3) 濾膜滅菌
將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置於沸水浴中煮沸滅菌3次，每次15min。前兩次煮沸後需要換水洗滌2～3次，以除去殘留溶劑。濾器用蒸汽滅菌器103.
43kpa（121℃，15lb）高壓滅菌20min。
(4) 水樣過濾
用無菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，貼放在已滅菌的濾床上，固定好濾器，將100ml水樣（如水樣含菌數多，可減少樣量，或加水樣稀釋）注入濾器中，開啟濾器閥門抽濾。
(5) 培養
水樣抽濾完後，再抽氣5s，關上濾器閥門，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然後將平皿倒置，放入37℃恆溫箱內培養24h。
(6) 結果觀察
a. 挑取符合特徵的菌落進行革蘭氏染色、鏡檢：
紫紅色、具有金屬光澤的菌落；
深紅色、不帶或略帶金屬光澤的菌落；
淡紅色、中心色較深的菌落。
b. 凡革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，再接種乳糖蛋白腖培養基，於37℃培養24h，有產酸產氣者則判定為總大腸菌群陽性。
c. 補充知識-革蘭氏染色：細菌先經鹼性染料結晶染色，而經碘液媒染後，用酒精脫色，在一定條件下有的細菌此色不被脫去，有的可被脫去，因此可把細菌分為兩大類，前者叫做革蘭氏陽性菌（g+），後者為革蘭氏陰性菌（g-）。
為觀察方便，脫色後再用一種紅色染料如鹼性蕃紅等進行復染。陽性菌仍帶紫色，陰性菌則被染上紅色。有芽胞的桿菌和絕大多數和球菌，以及所有的放線菌和真菌都呈革蘭氏正反應；弧菌，螺旋體和大多數致病性的無芽胞桿菌都呈現負反應。
(7) 樣品測定步驟
按下式計算濾膜上的總大腸菌群數，即：
總大腸菌群數（cfu/100ml）=
式中： m——數出的總大腸菌群數；
v——過濾的水樣體積（ml）
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