第一章基因工程
第一節基因工程概述
一．基因工程的概念
由於基因工程是在dna分子水平上進行操作,因此又叫做重組dna技術。
二．基因工程的基本工具
（一）「分子手術刀」——限制性核酸內切酶（簡稱限制酶）
1．**：主要是從原核生物中分離純化出來的。
2．功能：能夠識別雙鏈dna分子的某種特定的核苷酸序列，並且使每一條鏈中特定部位的兩
個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。
3．結果：經限制酶切割產生的dn**段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。
（二）「分子針線」——dna連線酶
1．分類：根據酶的**不同，可分為e·colidna連線酶和t4dna連線酶兩類
2．功能：恢復被限制酶切開了的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。
★兩種dna連線酶(e·colidna連線酶和t4dna連線酶)的比較：
①相同點：都縫合磷酸二酯鍵
②區別：e．coiidna連線酶**於大腸桿菌，只能使黏性末端之間連線；
t4dna連線酶能縫合兩種末端，但連線平末端之間的效率較低。
★dna連線酶與dna聚合酶作用的比較
(三) 「分子運輸車」——載體
1.載體具備的條件：
①能在受體細胞中複製並穩定儲存；
②具有一至多個限制酶切割位點，供外源dn**段插入；
③具有標記基因，供重組dna的鑑定和選擇。
2.基因工程常用的載體有： 質粒 、 噬菌體和動、植物病毒等。
最早應用的載體是質粒，它是細菌細胞中的一種很小的雙鏈環狀dna分子。
三．基因工程的基本過程
(一) 獲得目的基因（目的基因的獲取）
1.獲取方法主要有兩種：①從自然界中已有的物種中分離出來，如可從基因文庫中獲取。
②用人工的方法合成。
★獲得原核細胞的目的基因可採取直接分離，獲取真核細胞的目的基因一般是人工合成。
★人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法和化學合成法。
2.利用pcr技術擴增目的基因
（1）pcr的含義：是一項在生物體外複製特定dn**段的核酸合成技術。
（2）目的：獲取大量的目的基因
（3）原理：dna雙鏈複製
（4）過程：第一步：加熱至90～95℃dna解鏈為單鏈；
第二步：冷卻到55～60℃，引物與兩條單鏈dna結合；
第三步：加熱至70～75℃，熱穩定dna聚合酶從引物起始進行互補鏈的合成。
（5）特點：指數形式擴增
(二) 製備重組dna分子（基因表達載體的構建）
1．重組dna分子的組成：除了目的基因外，還必須有標記基因。
★標記基因的作用：鑑定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。
2．方法：同種限制酶分別切割載體和目的基因，再用dna連線酶把兩者連線。
(三) 轉化受體細胞（將目的基因匯入受體細胞）
1.轉化的概念：是目的基因進入受體細胞內，並且在受體細胞內維持穩定和表達的過程。
2.常用的轉化方法：
①將目的基因匯入植物細胞：採用最多的方法是農桿菌介導轉化技術（農桿菌轉化法），其次還有基因槍介導轉化技術（基因槍法）和花粉管通道技術（花粉管通道法）。
②將目的基因匯入動物細胞：最常用的方法是顯微注射技術。此方法的受體細胞多是受精卵。
③將目的基因匯入微生物細胞：ca＋處理法。
(四) 篩選出獲得目的基因的受體細胞、培養受體細胞並誘導目的基因的表達（目的基因的檢測與鑑定）
1.首先要檢測轉基因生物的染色體dna上是否插入了目的基因，方法是採用dna分子雜交技術。
2.其次還要檢測目的基因是否轉錄出mrna，方法是採用dna分子雜交技術。
3.最後檢測目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是採用抗原—抗體雜交技術。
4.有時還需進行個體生物學水平的鑑定。如抗蟲或抗病的鑑定等。
第二節基因工程的應用
1．運用基因工程改良動植物品種最突出的優點是：能打破常規育種難以突破的物種之間的界限。
2．基因工程的應用
（1）植物基因工程：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的品質。
（2）動物基因工程：提高動物生長速度來提高產品產量、改善產品品質，用轉基因動物生產藥物，用轉基因動物作器官移植的供體等。
（3）基因診斷和基因**：
基因診斷：又稱為dna診斷，是採用基因檢測的方法來判斷患者是否出現了基因異常或攜帶病
原體。基因**：指利用正常基因置換或彌補缺陷基因的**方法。
例項：ada基因缺陷症的基因**
第三節蛋白質工程
1．蛋白質工程的實質：根據蛋白質的結構與功能之間的關係，通過改造基因，以定向改造天然蛋白質，甚至創造自然界不存在的、具有優良特性的蛋白質。
2．蛋白質工程的基本原理
預期蛋白質功能→測定蛋白質三維空間結構→推測應有的氨基酸序列→找到對應的脫氧核苷酸序列（基因）→具有預期功能的蛋白質
3.蛋白質工程的應用
（1）通過改造酶的結構，有目的地提高蛋白質的熱穩定性。
（2）合成嵌合抗體。
（3）改變蛋白質的活性。
★蛋白質工程與基因工程區別
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