1、探針的分類
根據化學組成，可以將探針分為dna、rna、pna及寡核苷酸探針。
dna探針這類探針應用最廣，可以通過化學合成、轉殖或pcr技術獲得。
rna探針一般用rna聚合酶體外轉錄轉殖的dna序列獲得。rna-rna雜交分子在所有可能的雜交分子中最穩定，但rna探針容易被rnase降解。
肽核苷酸（pna）探針 pna寡聚物是一類新分子，其結構與dna相似。但在pna中，沒有核醣-磷酸基骨架，其骨架是不帶電的肽鏈(聚醯胺）
寡核苷酸探針它是根據探針靶序列的鹼基順序用化學方法合成的單鏈dna，其長度為15-20核苷酸。由於分子小，因此更容易滲透到細胞的目標區域；但也正由於分子小，限制了其所能攜帶的螢光基團或報告分子數目，並最終導致雜交後螢光訊號較弱。因此這類探針僅實用於對重複單位較短的高度重複序列的螢光原位雜交分析
2、dna純化方法
如果樣品中殘留的鹽和sds的濃度過高：酒精/naac沉澱，70%酒精洗
如果樣品中殘留的rna過多：rna酶37c半小時，酚/氯仿去除rna酶
如果樣品中殘留的蛋白質、酚過多：酚/氯仿去除
3、dna濃度測定
紫外分光法：
1 od260 = 50 g / ml ds dna（雙鏈）
40 g / ml ssdna / rn（單鏈）
計算舉例：
15 μl dna原液稀釋至3 ml (200倍), 測得od260 = 0.237, 則
[dna] = 0.237 ×50 ×200 = 2370 μg / ml = 2.4 μg / μl
點樣法：
1 μl濃度未知的樣品和1 μl已知濃度的標準品或上次實驗結果不錯的剩餘dna樣品分別與9 μl溴乙錠(10 mg / ml)混合，紫外燈下目測二者的濃度差別，據此調整樣品濃度後，再點樣觀察，直至二者濃度基本一致。
4、高通量測序技術的應用
重頭測序（de novo sequencing）
重測序（resequencing）
全轉錄組測序（whole transcriptome resequencing）
小分子rna測序（small rna sequencing）
染色質免疫共沉澱測序（chip-seq）
5、dna檢測應用
新藥研發、個性化基因診斷、癌症診療、 產前診斷、司法鑑定、食品安全、農牧業研究、環境保護、國防與軍事
dna雙螺旋結構模型要點：
dna分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核醣-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。螺旋直徑為2nm，形成大溝(major groove)及小溝(minor groove)相間。
鹼基垂直螺旋軸居雙螺旋內側，與對側鹼基形成氫鍵配對（互補配對形式：a=t; g c）
相鄰鹼基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對鹼基。
6、重組dna技術基本原理及步驟
目的基因的獲取
基因載體的選擇與構建
目的基因與載體的拼接
重組dna分子匯入受體細胞
篩選並無性繁殖含重組分子的受體分子**化子）
7、作為轉殖載體最基本的要求是：
①具有自主複製能力，否則目的基因就無法進行轉殖；
②攜帶易於篩選的選擇標記，用於篩選成功的重組dna，淘汰未重組的空載體；
③載體應盡可能小，便於匯入細胞和進行繁殖；
④使用安全。
8、外源 dna 匯入宿主細胞
將外源 dna 匯入宿主細胞是分子轉殖的關鍵步驟之一。其匯入方式是多種多樣的：外源 dna 匯入原核微生物細胞外源 dna 通過轉化、轉染以及感染等方式被匯入原核生物細胞。
①、轉化或轉染如果外源 dna 以重組質粒載體形式存在，則可通過轉化或轉染方式匯入原核細胞。無論轉化或轉染都需用氯化鈣處理宿主細胞，使其變得易於吸收外源 dna 的感受態細胞。
②、λ噬菌體的體外包裝與感染如果外源 dna 被包裝成λ噬菌體顆粒，則可通過噬菌體感染機制匯入宿主細胞。體外包裝是將重組 dna 分子與λ噬菌體的頭部、尾部以及有關包裝蛋白混合，從而組裝成完整具有感染力的噬菌體粒子。
基因槍(微粒子轟擊法)：是一種在高壓電極作用下，與微小金顆粒或鎢粉結合的dna，瞬間穿透細胞的細胞膜，進入靶細胞、組織和器官的基因轉移方法。微粒子進入細胞後，dna逐漸從粒子中釋放出來，開始表達。
dna顯微注射：
脂質體轉染法：非病毒載體中最具代表性的是陽離子脂質體(cationicliposome)，它具有可自然降解、無免疫原性等優點，已成為重要的體外基因轉移介質。陽離子脂質體通常由乙個單一的陽離子兩親化合物和乙個中性脂質組成。
陽離子脂質體與dna通過靜電作用相結合，構成脂質體—質粒複合體。脂質體—質粒複合體通過脂質之間的相互作用，與靶細胞融合進入細胞內，分解並釋放質粒dna，最後dna進入細胞核並在其中表達。
病毒介導的基因轉移:是以病毒為載體，將外源目的基因通過基因重組技術，將其組裝於病毒的遺傳物質中，通過這種重組病毒去感染受體宿主細胞，使外源目的基因在宿主細胞內表達。病毒載體在基因**領域的應用最為廣泛，大約70％的**方案採用了病毒載體，包括反轉錄病毒、慢病毒、腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、痘苗病毒等。
這些病毒載體有各自的特點，同時也存在各自的侷限性。
9、重組體的篩選與鑑定
在構建文庫之後就需要從眾多的轉殖中，篩選出含有目的基因的重組體，並鑑定其正確性。
這通常有三種鑑定方法：
一是重組體表型特徵的鑑定，
二是重組 dna 分子結構特徵的鑑定
三是外源基因表達產物的鑑定。
10、表達載體的構建
基因工程的主要目的是使外源基因能在細菌、酵母或動、植物細胞中得到高效表達，以便獲得大量有益的基因表達產物或改變微生物或動、植物的遺傳性狀。
所謂表達載體（ expression vector ）是指宿主細胞基因表達所需調節控制序列，能使轉殖的基因在宿主細胞內轉錄和翻譯的載體。也就是說，轉殖載體只是攜帶外源基因，使其在宿主細胞內擴增；表達載體不僅可使外源基因擴增，還可使其表達。
表達系統的要求與主要調控元件包括：啟動子、核醣體的結合位點、轉錄終止訊號和密碼子偏愛性等。
11、蛋白質的紫外吸收
色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等含共軛雙鍵氨基酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。
大多數蛋白質含有這幾種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法
12、蛋白質一級結構測定的步驟
蛋白質的分離純化
二硫鍵的拆分與保護
亞基分離
多種方法的部分水解
分離水解後得到的多肽
測序重疊
二硫鍵位置的確定
13、蛋白質間的相互作用力
蛋白質內部：肽鍵
蛋白質間：非共價鍵、氫鍵、范德華力、疏水鍵、 離子鍵
14、同源異形結構域（homeodomains，hd）
是一種編碼60aa的序列，長180bp，它存在於很多控制果蠅早期發育基因中，在高等生物中也發現了相關基序。
hd的c-端區域和原核阻遏蛋白的hth同源，但也有幾點不同:
（1）hd的c端由3個α-螺旋構成，螺旋3結合於大溝，長17aa；而阻遏蛋白由5個α-螺旋構成，螺旋3長僅9個 aa；
（2）原核的hth的以二聚體形式與dna結合，靶序列是回文結構，而hd是以單體形式與dna結合，靶序列不是回文結構；
（3）hd n-端的臂位於小溝，而hth螺旋1的末端與dna的背面接觸。
15、蛋白質和配基的結合
甾類受體蛋白一般都具有3個不同的功能區：
（1）n-端區是啟用轉錄所需的區域，不同受體之間此區的同一性僅小於15%；
（2）dna結合及轉錄活化區，同一性較高為94-42%；
（3）c-端的激素結合和二聚體形成區，同一性為57-15%。
16、生物大分子相互作用研究方法
噬菌體展示
酵母雙雜交技術
免疫共沉澱
染色質免疫沉澱技術
表面等離子共振
螢光共振能量轉移
串聯親和純化
17、酵母雙雜交系統
典型的真核生長轉錄因子， 如gal4、gcn4、等都含有二個不同的結構域: dna結合結構域(dna-binding domain)和轉錄啟用結構域(transcription-activating domain)。前者可識別dna上的特異序列， 並使轉錄啟用結構域定位於所調節的基因的上游， 轉錄啟用結構域可同轉錄複合體的其他成分作用， 啟動它所調節的基因的轉錄。
將編碼某一蛋白x的dna序列與dna結合域bd的編碼序列融合形成乙個雜交體，將編碼另一蛋白y的dna序列與dna啟用域ad的編碼序列融合形成另乙個雜交體，當兩個雜交體共轉化酵母細胞（此酵母細胞上游有dna結合位點的報告基因），若x和y沒有相互作用，則單獨不能啟用報告基因的轉錄；若x和y可相互作用，則使bd和ad靠近形成乙個有效的轉錄啟用子，啟用報告基因的轉錄。因此可通過檢測報告基因的轉錄來研究蛋白質x和y的相互作用
用途：1）已知蛋白之間相互作用的檢測：
2）蛋白質的功能域研究：通過對其中某乙個蛋白質作缺失或定點突變，再用此系統檢測是否還存在相互作用，可闡明其功能域或關鍵氨基酸；
3）轉殖新基因和新蛋白：將感興趣的蛋白質基因與bd基因構建成「誘餌」表達質粒，將某一器官或組織的cdna文庫與ad基因構建成「獵物」基因庫，共轉化酵母細胞，可篩到與感興趣蛋白質相互作用的蛋白質的cdna序列，並推測其蛋白質序列。
優點：1）蛋白--蛋白相互作用是細胞進行一切代謝活動的基礎。酵母雙雜交系統的建立為研究這一問題提供了有利的手段和方法。
2）大規模篩選
3）操作簡單，直觀（可以用螢光做報告基因，也可以用氨基酸缺陷型平板篩選等）
生物化學複習
27 酶是產生的，具有催化活性的 28 糖酵解過程中有3個不可逆的酶促反應，這些酶是和 29 trna的二級結構呈 形，結構呈形，其3 末端有一共同鹼基序列其功能是 30 dna 主要分布在rna 重要分布在 31 因為核酸分子具有所以在nm處有吸收峰。32 肽鍵是通過乙個氨基酸的基和另一氨基酸的 ...
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生物化學總結
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