一、目的要求
1. 掌握微生物實驗室常用玻璃器皿的清洗及包紮方法。
2. 掌握培養基的配置原則和方法。
3. 掌握高壓蒸汽滅菌的操作方法和注意事項。
二、基本原理
營養瓊脂培養基：
是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時又稱為普通培養基。由於這種培養基中含有一般細胞生長繁殖所需要的最基本的營養物質，所以可供細菌生長繁殖之用。
高壓蒸汽滅菌：
主要是通過公升溫使蛋白質變性從而達到殺死微生物的效果。將滅菌的物品放在乙個密閉和加壓的滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋內水沸騰而產生蒸汽。待蒸汽將鍋內冷空氣從排氣閥中趨盡，關閉排氣閥繼續加熱。
此時蒸汽不溢位，壓力增大，沸點公升高，獲得高於100℃的溫度導致菌體蛋白凝固變性，而達到滅菌的目的。
三、實驗材料
1. 藥品：營養瓊脂、蒸餾水。
2. 儀器及玻璃器皿：天平、高壓蒸汽滅菌鍋、移液管、試管、燒杯、量筒、錐形瓶、培養皿等。
3. 其他物品：藥匙、稱量紙、ph試紙、記號筆、棉花等。
四、操作步驟
（一）玻璃器皿的洗滌和包裝
1．玻璃器皿的洗滌
將玻璃器皿浸入含有洗滌劑的水中．用毛刷刷洗，然後用自來水及蒸餾水沖淨。再置於烘箱中烘乾後備用。
2．滅菌前玻璃器皿的包裝
（1） 培養皿的包紮：培養皿由一蓋一底組成一套，用報紙按傳統包月餅的方法，將幾套培養皿包成一包，準備滅菌。
（2） 移液管的包紮：
先將報紙裁成寬約5cm的長紙條，然後將移液管尖端放在長條報紙的一端，約成45℃角，摺疊紙條包住尖端，用左手握住移液管身，右手將移液管壓緊。在桌面上向前搓轉，以螺旋式包紮起來。上端剩餘紙條，摺疊打結，準備滅菌。
（3）無菌水的製備：往兩支潔淨的試管中分別加入10ml蒸餾水，用試管塞塞好，準備滅菌。
（二）固體培養基的配製過程
1．培養基配製
（1）稱取4g營養瓊脂，溶於125ml的蒸餾水中，加熱使其完全溶解。
（2）培養基的分裝
分裝時，將4支洗淨的試管放置在試管架上，用5ml的移液管分別移取適量的上述溶液於試管中（裝入量不宜超過試管高度的1/5）；將剩餘溶液倒入錐形瓶中（裝入量以錐形瓶總體積的一半為限度），用橡皮塞塞好瓶口。
（3）試管、錐形瓶的包紮
將上述所有試管（包括盛裝無菌水的試管）捆成一捆。然後，將捆好的試管與錐形瓶標明組別與日期。
（4）培養基的滅菌
將包紮好的玻璃器皿與捆好的試管與錐形瓶在高壓滅菌鍋中常壓，121℃條件下滅菌20min。
（5）斜面的製作
將已滅菌裝有瓊脂培養基的試管，趁熱置於木棒或玻棒上，使成適當斜度（斜面長度不超過試管長度l／2為宜），凝固後即成斜面。。
（6）平板的製作
在火旁進行，左手拿培養皿，右手拿三角瓶的底部，左手同時用小指和手掌將塞子開啟，灼燒瓶口，用左手大拇指將培養皿蓋開啟一縫，至瓶口正好伸入，將裝在錐形瓶中已滅菌的培養基，待冷至50℃左右分別傾入10~12ml培養基，於2個無菌培養皿中，迅速蓋好皿蓋，置於桌上，輕輕旋轉平皿，使培養基均勻分布於整個平皿中，冷凝後即成平板。
五、實驗過程原始記錄
營養瓊脂：4g
1、4g黃色營養瓊脂粉，完全溶於125ml蒸餾水後，得到橙黃色的，透明的膠體溶液。
2、將營養瓊脂液按實驗步驟操作，冷卻至室溫後，即得到無色（略帶黃色）的膠狀培養基。
六、結果及討論
（一）實驗結果
成功的製備出了斜面和固體培養基，使後續細菌接種試驗順利進行。但仍存在些缺陷，有待改進。
1、理論上，培養基分裝於試管後，應用棉塞封好試管口，且棉塞的***壞直接影響試驗結果。但試驗時，使用試管塞封口，由於試管塞一般不透氣，在滅菌的公升溫和降溫過程中，試管內外壓力會有差異，當管內壓力大於管外壓力時可能使塞子飛出或試管爆裂。而棉花塞透氣，能保持內外壓平衡，且阻止細菌進入。
2、動手能力差，有時不知所措；且操作粗心大意，損壞玻璃器皿。
（二）、注意事項：
1、在瓊脂加熱溶解的整個過程用玻棒不斷攪勻，防止瓊脂粘在燒杯底部而使燒杯破裂；同時也使其充分溶解，避免培養基製作失敗，必要時可補足因蒸發而失去水分至總體積。
2、一般情況下在配製固體培養基時，溶解的瓊脂液無須過濾。必要時，可趁熱用4—5層紗布過濾。
3、根據不同需要，可將已配好培養基分裝入試管或錐形瓶內，分裝時注意不要使培養基沾汙管口或瓶口，造成汙染，如操作不小心，培養基沾汙管口或瓶口時，可用鑷子夾一小塊脫脂棉，擦去管口或瓶口的培養基，並將脫脂棉棄去。
4、平板製作時，將已滅菌的培養基待冷至50℃時傾入培養皿；若溫度過高時，則皿蓋上的冷凝水太多；反之，培養基易於凝固而無法製作平板。
5、滅菌時，以滅菌最徹底而營養破壞最少，且方法最簡便為原則。加壓之前，冷空氣一定要完全排盡，以提高滅菌效果；恆溫滅菌時，最好等自然使表壓減至「0」以後，才能開啟滅菌鍋蓋。
（三）思考題回答
1、黴菌時，塞試管的棉塞是否可以用橡皮塞代替？為什麼？
答：不可以，因為橡皮塞不透氣，在滅菌的公升溫和降溫過程中，試管內外壓力會有差異。當管內壓力大於管外壓力時可能使塞子飛出或試管爆裂。
而棉花塞透氣，能保持內外壓平衡，且能阻止細菌進入。
2、如何檢查所配置的培養基無菌？
若沒有滅菌，一定有菌。而有滅菌，則置於37℃恆溫箱中培養，兩三天觀察表面有無菌落形成。若無，證明培養基無菌，反之亦然。
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