生物化學實驗報告
一、實驗目的
1.1 學習並掌握動物細胞培養的無菌操作技術。
1.2 了解並掌握用組織塊貼壁培養法和消化細胞培養法進行動物細胞原代培養的實驗方法。
1.3 熟練掌握動物細胞傳代培養的實驗方法。
1.4 學習細胞生死狀態鑑別的方法。
1.5 了解細胞生死狀態鑑別的原理。
1.6 熟悉和掌握各種鑑別細胞生死狀態方法的判定特徵。
1.7 掌握細胞技術方法，計算細胞存活率
二、實驗原理
細胞培養指的是在無菌條件下，把動、植物細胞從組織中取出，在體外模擬體內的生理環境，使離體的細胞在體外生長和繁殖，並且維持其結構和功能的一種培養技術
細胞生死狀態的鑑別方法主要是化學染色法和螢光染色法。
活細胞和死亡細胞在生理技能和性質上主要存在一下差異：
①細胞膜通透性的差異：活細胞的細胞膜是一種選擇性膜，對細胞起保護和屏障作用，只允許物質選擇性地通過；而細胞死後，細胞膜受損，其通透性增加。基於此，發展出了以台盼藍、伊紅、苯胺黑、赤蘚紅、甲基藍以及螢光染料碘化丙啶或溴化乙啶等為染料鑑別細胞生死狀態的方法，上述染料能使死亡細胞著色，而活細胞不被著色。
此外，應用植物質壁分離的性質也可鑑定植物細胞的生死狀態。活細胞的原生質具有選擇透過性，死細胞因其原生質的選擇透過性已遭破壞，故與高滲透壓溶液接觸時不產生質壁分離。
②代謝上的差異：活細胞中新陳代謝作用強，細胞內的酶具有較強的活性和還原能力。基於此，發展處了以螢光素二乙酸酯（fda）、螢光素二丙酸酯、螢光素二丁酸酯或螢光素二苯甲醯酯等酯化的螢光素鑑別細胞生死狀態的方法，上述酯化的螢光素親脂性提高，容易被細胞吸收進入，活細胞內的酯酶具有較強的活性，可將酯化的螢光素分解而釋放出能發螢光的螢光素，該物質不能自由透過活的細胞膜，積累在細胞內，螢光顯微鏡下顯示有明亮的綠色或黃綠色螢光；而死亡細胞內的酯酶因失去活性，不能分解酯化的螢光素，螢光顯微鏡下顯示不發光。
另外，可用亞甲基藍為染料鑑定酵母細胞的生死狀態。亞甲基藍是一無毒染料，氧化型為藍色，還原型為無色。活細胞因具有較強的還原能力，能使亞甲藍從藍色的氧化型變成無色的還原型，故活的酵母細胞在用亞甲基藍染色後顯示無色；死亡酵母細胞或代謝緩慢的衰老酵母細胞，因無還原能力或還原能力極弱，使亞甲藍仍處於氧化態，故呈現藍色或淡藍色。
三、實驗器材
3.1器材：解剖剪、解剖鑷、培養皿、紗布塊、試管、錐形瓶、吸管、橡皮頭、l型注射器、離心管等。上述器材需徹底洗淨、烤乾、包裝好，滅菌，備用。
超淨工作台、co2培養箱、普通光學顯微鏡、離心機、血球計數板、酒精燈、酒精棉球、試管架、記號筆、解剖板、蓋玻片等。
3.2 試劑：培養液、pbs液0.4%台盼藍染液
3.3 材料：小白鼠
四、操作步驟
4.1 取材
取小白鼠乙隻，採用斷頭法處死：清水洗小鼠並浸於75%酒精中滅菌3分鐘。取出轉入超淨工作台內的解剖盤內，無菌操作開啟腹腔。
取出脾臟，去除其周圍的脂肪組織，鑷起脾臟用pbs液自上而下沖洗1—2次。轉入無菌玻璃培養皿，待用。
4.2分離脾細胞
4.2.1 用滴管先向上述無菌玻璃培養皿中滴入pbs液30滴，再用「l」型針頭注射器在皿中吸取pbs液0.2ml，然後將其沿脾長軸方向注射入脾內（使脾臟膨脹以利於細胞散開）。
4.2.2 用針尖在脾臟上扎眼，並用「l」針頭輕刮脾臟表面擠出脾細胞，用滴管吸皿中的pbs液衝脾臟並吹散刮出的脾細胞，稍傾斜並靜置1—2分鐘。
4.2.3 吸取上述靜置後的脾細胞懸液上清部分放入eppendorf發管，並使量至1ml，以3000r/分離1—2分鐘。
4.3培養脾細胞
4.3.1 超淨工作台中取塑料培養皿乙個，用移液槍（1000μl）加入細胞培養液2ml，並在皿蓋上畫上標記，待用。
4.3.2 取上述離心後的eppendorf管，在超淨工作台內開蓋棄去上清液，用移液槍（200μl）吸取塑料皿中的培養液400ml加入棄去上清液的eppendorf管中，用槍頭吹勻管底的脾細胞，然後吸取200ml脾細胞懸液接種於上述塑料培養皿中，混勻，然後放入37℃、5%二氧化碳培養箱中培養。
4.4台盼藍法鑑定細胞的生死狀態：
4.4.1 試劑配製：用生理鹽水配置0.4%台盼藍染液，備用。
4.4.2 染色計數：
取0.5ml細胞懸液放於乾淨的試管中，加1-2滴（約0.1ml）染液，混合2-5min，滴加少許染色後的細胞懸液於放有蓋片的血球計數板的斜面上，使懸液自然充滿計數板小室。
注意不要使小室內有氣泡產生，否則要重新滴加。在普通光鏡10倍物鏡下計數四個大格內的細胞數，壓線者數上不數下，數左不數右。
4.4.3 根據染色結果計算活細胞率：依據死細胞染成藍色、活細胞不著色的原則計數死細胞數和細胞總數，以如下公式計算細胞存活率：
細胞存活率=（細胞總數-死亡細胞數）/細胞總數*100%
4.5 關於血球計數板
4.5.1 血球計數板是一塊特製的厚載玻片，載玻片上有四條槽而構成三個平台。
中間的平台較寬，其中間又被一短橫槽分割成兩半，每個半邊上面各有有乙個方格網，每個方格網共分九大格，其中間的一大格（又稱計數室）常被用作細胞的計數。
計數室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格,而每個中方格又分成25個小方格；另一種是乙個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數室是哪一種構造，他們都有乙個共同特點，即每個大方格都有400個小方格組成。
圖1 血球計數板的構造(a、平面圖；b、側面圖)
圖2血球計數板網格的分割槽和分格
每個大方格邊長為1mm,則每一大方格的面積為1mm2,每個小方格的面積為1/400mm2,蓋上蓋玻片後，蓋玻片與計數室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數室（大方格）的體積為0.1mm3，所以每個小方格的體積為1/400mm3若取四個大方格的細胞數，則：
每毫公升液體中細胞的數=每個大方格中的細胞數量*10000*稀釋倍數
4.5.2 此次實驗中，使用的是前一種血球計數板，因此分別選取左上、左下、右上、右下四個中方格進行計數。
五、注意事項
5.1 在進行方格查數時注意：數上不數下，數下不數上。
5.2實驗涉及的臺盼藍染料有致癌危險，因此滴加染液時要小心，防止濺到**上。
5.3 動物細胞培養使用的所有器皿、用具、溶液等必須經過嚴格消毒或除菌處理，才能進超淨工作台中使用，整個實驗過程都要有無菌操作的概念，避免細胞被汙染。
5.4 在超淨工作台內點燃酒精燈後，實驗操作應在火焰的附近進行，耐熱物品要經常在火焰上燒灼，金屬器械燒灼後要待其冷卻才能夾取組織，經過培養液的用具不能長時間燒灼，以免燒焦形成碳膜。
5.5 超淨工作台內吸取溶液用的的各種吸管等不能混用，以免相互汙染。
5.6 在超淨工作台中，組織細胞、培養液等不能敞開暴露過久，以免溶液蒸發和ph變化。
5.7器皿、離心管培養瓶等在離開超淨工作台前必須將蓋子或橡皮塞蓋緊，以防止細胞汙染或溶液漏出。
六、實驗結果
每大格細胞總數平均值為110，每大格平均死亡細胞數為77
每毫公升溶液中細胞總數=110*10000*2=2.2*106個
細胞存活率=（110-77）/110*100%=30.0%
七、分析與討論
7.1 實驗資料討論
此次實驗，我組測得細胞存活率為30.0%，經過交流，有些組的細胞存活率達到44.6%，分析存活率相對較低的原因如下：
7.1.1 無菌操作的過程中操作不規範，導致染菌，會影響觀察，導致實驗失敗；
7.1.2 在離心分離呈單細胞的過程中離心機轉速過快或時間過長很可能會導致細胞破裂，導致小鼠脾細胞大量死亡；
7.1.3 染色時間過長，或觀察時間過長都會導致染色試劑將細胞殺死，使細胞活力驟降，這是導致細胞活力比較低的重要原因；
7.1.4 實驗中的一些操作不正確或不規範的情況、計算帶來的誤差等也會直接導致實驗誤差。
7.1.5取液時沒有搖勻細胞液，導致取液不均勻。
7.1.6 培養時間過長，養分耗盡。
7.2 關於支原體汙染
此次實驗中，有同學培養的細胞被真菌汙染，細胞被細菌或真菌汙染時很容易檢測和預防，而因為它極小，直徑在0.2-2μm，可以輕鬆地通過濾膜，混入培養系統中；而且它沒有剛性的細胞壁，因此普通的抗生素對它根本不起作用。基於以上兩點，它即使生長到很高密度，也沒有明顯的汙染跡象。
細胞培養，特別是傳代細胞，被支原體汙染是個世界性問題。有研究報告稱25%的細胞都存在支原體汙染。
由於體外培養細胞自身沒有抵抗汙染的能力，而且培養基中的抗生素抗汙染能力有限，因而培養細胞一旦發生汙染多數將無法挽回。支原體汙染後，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養基一般不發生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響dna合成，抑制細胞生長等。
支原體汙染的**包括工作環境的汙染、操作者本身的汙染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養基的汙染、被汙染細胞造成的交叉汙染、實驗器材的汙染、製備細胞的原始組織或器官的汙染，等等。
此次細胞培養實驗幾乎全部都是在無菌條件下進行，培養基和器材都保證無菌，並對實驗操作進行了嚴格規範，基本能夠保證避免支原體汙染。
課後作業
1.抑制腫瘤細胞增殖藥物的篩選方法
1.1 mtt分析法
以活細胞代謝物還原劑3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,mtt噻唑藍為基礎。mtt為黃色化合物，是一種接受氫離子的染料，可作用於活細胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細胞色素c的作用下tetrazolium環開裂，生成藍色的formazan結晶，formazan結晶的生成量僅與活細胞數目成正比(死細胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將mtt還原)。還原生成的formazan結晶可在含50%的n，n-二甲基甲醯胺和20%的十二甲基磺酸鈉(ph 4.
7)的mtt溶解液中溶解，利用酶標儀測定490 nm處的光密度od值，以反映出活細胞數目。也可以用dmso來溶解。
實驗十酵母菌形態觀察及死活細胞鑑定
一目的要求 1.觀察酵母菌的形態及出芽生殖。2掌握酵母菌的死活細胞的鑑定方法.二.實驗原理 本實驗通過用美藍染色製成水浸片，來觀察生活的酵母形態和出芽生殖方式。美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細胞進行染色，由於細胞中新陳代謝的作用，使細胞內具有較強的還原能...
細胞培養室的建立
細胞培養室的設定 裝置和準備工作 一 細胞培養實驗室的設定及裝置 一 細胞培養實驗室的設定 組織細胞培養技術與其他一般實驗室工作的主要區別在於要求保持無菌操作，避免微生物及其他有害因素的影響。目前，超淨工作台的廣泛使用，很大程度上方便了組織細胞培養工作，並使一些常規實驗室有可能用於進行細胞培養。細胞...
細胞的測量與觀察實驗報告
細胞的觀察和測量 一 實驗目的 根據光學顯微鏡的構造和原理，以及使用低倍鏡的經驗和技能，學習高倍鏡的使用方法和注意事項。二 實驗材料 顯微鏡 顯微鏡目鏡測微尺 蠶豆葉下表皮永久裝片。三 實驗過程 1 低倍鏡的使用 安置顯微鏡 調節粗調節器 觀察 調光。2 高倍鏡的使用 需要觀察部位移至視野 轉換高倍...