段慧琴1，張永東2，穆祥1*
(1.北京農學院動科系，北京 102206；2.北京農業職業學院，北京 102442)
摘要：微血管內皮細胞在許多病理生理過程中起著關鍵性的作用。應用體外培養的微血管內皮細胞，不僅廣泛應用於微迴圈系統對不同生理或病理刺激的反應，也可闡明伴隨微血管功能障礙和組織損傷的某些疾病的病理機制，所以分離培養動物及人各個器官組織微血管內皮細胞的報道日漸增多。
微血管內皮細胞分離方法主要有3種，包括酶消化法、機械分離法和磁珠分離法，每種方法各有利弊。微血管內皮細胞一般通過其表面的血管緊張素酶、攝取乙醯基低密度脂蛋白和表達ⅷ因子相關抗原進行鑑定。目前從不同組織器官分離培養微血管內皮細胞的方法已經比較成熟。
關鍵詞：微血管內皮細胞；體外；分離培養
從2023年jaffe e a等成功培養人的臍靜脈內皮細胞至今，血管內皮細胞的研究已經取得了重要的進展，極大地豐富了人們對血管內皮細胞的認識。研究資料已經證實，動脈起源的內皮細胞不同於靜脈起源的內皮細胞，微血管內皮細胞不同於大血管的內皮細胞[1]，並且不同器官組織起源的血管內皮細胞也表現出不同的功能特性。微血管內皮細胞所表現的組織器官特異性，使人們認識到微血管內皮細胞研究的重要性。
因此，研究發生於某一器官或組織的微血管病變，應該採用這一器官或組織的微血管內皮細胞作為細胞模型。因此，微血管內皮細胞的培養技術越來越受到人們的重視，已經成為醫學研究中不可缺少的重要手段。但是，由於微血管內皮細胞的培養難度較大，研究成本較高，因而它的普及和應用都受到一定的限制。
近年來，內皮細胞生長因子的應用和免疫磁珠技術的發展，使微血管內皮細胞的培養和純化變得相對簡化，加之許多微血管內皮細胞系的建立，使得微血管內皮細胞的研究及應用得到迅速發展。
1 微血管內皮細胞體外培養狀況
到目前為止，人體主要器官和組織的微血管內皮細胞已經培養成功。主要是骨骼肌[2]、心[3-4]、腦[5]、胃[6-8]、視網膜[9]、肺[10]、**[11]、脈絡膜[12]和小腸[13]微血管內皮細胞的培養，培養成功的還有脂肪、肝竇、腎、關節滑膜、胎盤、骨髓、胰島、角膜及食道等器官組織的微血管內皮細胞。這些不同器官和組織微血管內皮細胞的研究，對於認識和了解組織器官內皮細胞的功能特性及對相關疾病的研究提供了有力的工具。
國內關於動物源性微血管內皮細胞的培養研究主要集中在大鼠的小腸[14]、肺臟[15]、腦[16]、兔腦[17]和牛視網膜[18]等器官組織。
2 微血管內皮細胞分離培養純化方法
2.1 分離方法
微血管內皮細胞的分離是將剪碎的組織浸泡在消化酶中，因酶的消化一般是由外向裡，所以最後被消化下來的細胞才是內皮細胞。因此，徹底地消化組織是獲得足夠微血管內皮細胞的前提，且非血管內皮細胞的汙染是不可避免的。為了能分離獲得足夠的微血管內皮細胞，採用過量的酶消化是必要的。
一般情況下，應用2 g/l的ⅰ型或ⅱ型膠原酶消化20 min～30 min。在某些情況下，需要再採用1 g/l胰蛋白酶/0.1%edta溶液進行二次消化，但總消化的時間應控制在30 min以內，以減少微血管內皮細胞的損傷。
消化後的組織懸液需要用血清終止酶活性，並將組織懸液通過200目的金屬篩去除未消化組織。
目前分離內皮細胞的方法主要有3種，即酶消化法、機械分離法和磁珠分離法。幾種不同的分離內皮細胞的方法均有優勢和侷限性，常用的是酶消化法。其優點是分離的細胞多，純度較高，缺點是酶對某些表面蛋白有破壞作用；後兩種方法可以避免酶對內皮細胞的損傷，缺點是其他細胞的汙染可能性較大。
磁珠分離法是利用特異的介質(表面有內皮細胞特異單轉殖抗體的磁珠)從其他細胞群中分離出內皮細胞。這種方法雖然可以分離出可用於炎症研究的微血管內皮細胞，但是分離的細胞量少。機械法一般用於大血管內皮細胞的分離，這種方法避免了酶對內皮細胞的損傷和其他細胞的汙染。
2.2 細胞的純化
由於在微血管內皮細胞的分離過程中必然伴隨非血管內皮細胞的汙染，因此微血管內皮細胞的純化是決定微血管內皮細胞培養成功與否的關鍵，也是微血管內皮細胞培養的技術難度所在。目前已經建立了多種微血管內皮細胞純化的方法，並在不同器官和組織微血管內皮細胞的培養中獲得成功。在一種微血管內皮細胞的純化中，往往會在細胞培養的不同階段，根據細胞的特性、細胞的生長狀態和汙染的細胞型別採用不同的純化方法。
例如，腸黏膜微血管內皮細胞的培養需要採用區域性消化和差速黏附的分離手段得到純度較高的內皮細胞。在內皮細胞達到區域性匯合時應用酶消化純化血管內皮細胞。一般說來，這些純化方法各有利弊，在一種細胞的分離中如何選擇純化的方法主要取決於操作者的經驗。
目前，微血管內皮細胞純化的方法主要有利用尼龍網或不鏽鋼網篩過濾細胞懸液、物理刮除法、生長特性選擇法、區域性消化法、差速黏附法和免疫磁珠法等，可以根據不同細胞的培養特性或生物特性選擇其中幾種方法進行純化。
生長特性選擇法是根據內皮細胞的生長特性加以分離，即已貼壁的組織塊，培養一段時間後除血細胞外，其他細胞尚未離開組織塊而微血管內皮細胞最先遊出，這時立即移去組織塊，所留的大部分是血細胞和內皮細胞，血細胞經傳代1代至2代後自動消除，剩下便是微血管內皮細胞。這種方法由於避免了對細胞的機械和化學損傷，且不需特殊裝置，操作簡單，較為可取。
區域性消化法是當不同型別的細胞群之間界限明顯時，可在目的細胞區域滴加少量的消化酶，作用一段時間後，將消化液連同細胞吸出，再離心除去消化酶或終止消化後，將細胞接種於另外的培養板孔中進行培養。這種方法同物理刮除法一樣，要求目的細胞的相對數量要大，並且與其他細胞界限相對明顯。
差速黏附法，即根據不同細胞在生長表面黏附強度和對消化酶耐受性的不同，將目的細胞和汙染細胞分開。因為內皮細胞較成纖維細胞貼壁牢固，用2.5 g/l的胰酶消化細胞，在倒置顯微鏡下監視，當成纖維細胞收縮變圓脫壁時，立即用含胎牛血清的培養基終止消化，隨後輕輕吸去細胞液，大多數內皮細胞仍然保留在原培養板孔中。
經過數次同樣的處理，成纖維細胞基本可以被除去。
2.3 內皮細胞的鑑定
到目前為止，還沒有發現不同器官組織的微血管內皮細胞具有共同的特異蛋白或標誌。因此，微血管內皮細胞的鑑定大多是根據器官和組織的起源，從形態、表型、生化和功能等方面進行綜合評價。微血管內皮細胞一般呈單層生長，有接觸抑制現象，呈典型的鋪路石狀，電鏡下可以看到weibel-palade小體。
其表面可以表達cd31、cd34、凝血調節蛋白和第ⅷ因子等，可以攝取低密度脂蛋白，產生前列腺素(pgi2和pge2)，表達e-選擇素，內吞功能，結合植物血凝素，形成毛細血管樣網路[19]。
不管利用那種方法，培養的內皮細胞都可根據某些特徵進行鑑定。內皮細胞可以利用其表面表達血管緊張素合成酶、攝取乙醯化低密度脂蛋白及第ⅷ因子的表達進行鑑定。這些特性並不是內皮細胞特有的，間皮細胞也可以攝取乙醯化低密度脂蛋白。
內皮細胞在培養條件下可以形成管形，像原始血管形成或損傷後血管再生，這被認為是內皮細胞獨有的特徵。但有報道說培養的上皮也可以形成管形。因此，一般情況下研究者們採用最有利的方法獲得高純度的內皮細胞，並用多種方法進行鑑定。
2.4 微血管內皮細胞的培養要點
根據微血管內皮細胞的生長特性，需要採用一些特殊的培養條件，並且這些培養條件可能因為微血管內皮細胞的起源不同而有所差異。微血管內皮細胞的培養一般選用dmem、m199等基礎培養基，ph 7.2，新增150 ml/l～200 ml/l的胎牛血清、1 000單位/ml雙抗，20 g/l谷氨醯氨，還需新增內皮細胞生長因子(一般新增濃度為1%)。
根據其接觸抑制現象需及時進行傳代培養。
3 腸黏膜微血管內皮細胞的體外分離培養
體外培養的內皮細胞的分離、生長以及研究已有數十年了，已具備從不同種屬不同器官系統分離內皮細胞成熟的技術和方法。關於腸黏膜微血管內皮細胞的體外培養，在國內尚未見報道。國外已成功的分離和培養了正常和病理情況下人腸微血管內皮細胞[13]。
索佔偉等[14]選用24 h內的sd大鼠乳鼠空腸作為細胞**，是因為乳鼠的腸黏膜微血管更為豐富，且分離的組織塊易貼壁，增殖分化能力強。儘管從胃腸道分離微血管內皮細胞技術難度較大，但是可以通過體外模型來直接分析比較正常和病理狀態下血管內皮細胞的功能。試驗採用組織塊貼壁法成功培養出原代大鼠腸黏膜微血管內皮細胞，再通過區域性消化和差速黏附的分離手段得到純度較高的內皮細胞。
他們認為，該方法是一種簡單、經濟、重複性好的腸黏膜微血管內皮細胞的培養方法。得到的腸黏膜微血管內皮細胞生物特性相對穩定，並可傳15代以上。
4 展望
微血管內皮細胞主要定位於進行血液-組織交換的微血管，因此廣泛地涉及各種疾病的發病機制。其中與微血管內皮細胞關係密切的疾病包括以下5類：①炎症與感染；②免疫與自家免疫；③心血管疾病；④腫瘤的生長與轉移；⑤移植排斥反應。
應用體外培養的微血管內皮細胞，可以構建各種實驗模型來研究生理和病理情況下微血管內皮細胞的基因、表型和功能，以及與各種組織細胞相互作用及其調控機制。微血管內皮細胞在醫學方面的研究具有廣泛的應用價值，如構建血管內皮細胞屏障模型，研究藥物的轉運和細胞遷移，通過缺氧-再氧化研究血管內皮細胞缺血-再灌注損傷，構建血管發生模型研究腫瘤的生長和抗血管發生藥物等方面將發揮重要作用。
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