pcr 產品
無擴增條帶：
1. 正對照樣品或者內參基因引物均沒有有效擴增
1.1 檢測試驗步驟、試劑、體系、程式是否正確。
1.2 相同模板，使用某公司產品可以有效擴增，而換用另一公司產品不能有效擴增
1）不同產品，相同模板，但擴增條件存在差異，需要摸索試驗條件，如降低退火溫度，或增加模板濃度。
2）一些產品對某些基因不適合擴增。
解決方法：如使用mix沒有有效擴增，給客戶換成酶，或換成其他mix或者酶，嘗試哪種產品最適合。
2. 正對照樣品或者內參基因引物擴增，而實驗樣本沒有有效擴增
2.1 反應體系：
1）模板不純或者有抑制物：建議純化模板或將模板進行梯度稀釋，以確定合適的濃度。
2）引物擴增效率低：重新設計引物或者更換引物。
2.2反應條件：
解決方法：降低退火溫度，增加延伸時間，增加迴圈次數。
2.3 需要擴增效率更高的酶或mix，建議使用增強型的es taq mastermix，或goldstar taq mastermix。
非特異性擴增：
有非特異性擴增條帶或者有拖尾現象
1.1 反應體系：
1）模板與引物濃度過高：降低模板或者引物量，降低dntp濃度。
2）模板純度：純化模板
3）引物特異性：重新設計引物或者更換引物。
1.2反應條件：
解決方法：提高退火溫度，降低延伸時間，降低迴圈次數。
2.3 需要特異性更高的酶或者mix，建議使用熱啟動酶和mix。
goldstar taq 和goldstar best
瓊脂糖凝膠檢測正常，而使用聚丙烯醯胺凝膠電泳，銀染後有背景條帶。
解決方案：給客戶調換成無bsa的pcr 酶或者mix。
逆轉錄產品
逆轉錄反應結束後，pcr檢測：
1.1 pcr檢測內參基因能夠有效擴增，但目的基因不能有效擴增，說明逆轉錄正常，而目的基因的pcr擴增需要優化實驗體系。
1.2 pcr檢測內參基因和目的基因均不能有效擴增，需檢測rna質量和逆轉錄過程。
檢查rna質量
1.1 電泳檢測rna完整性：28s和18s兩條帶，或同時有5s條帶。無降解。
1.2分光光度計或者nodrop檢測rna濃度和得率：
對於super rt 逆轉錄酶要求rna的加入量為1ng-5ug。
對於hifi-mmlv 逆轉錄酶要求rna的加入量為10ng-5ug。
逆轉錄：
1.1檢測rt反應液加入到pcr或real-time pcr的體積是否過高。將得到的rt反應液（cdna溶液），其加入量不要超過pcr反應體積的10%。
1.2 逆轉錄反應體系和程式建議首先按照說明書上的第一種逆轉錄操作步驟進行，即42℃孵育50分鐘，70℃孵育15分鐘。
1.3 如果逆轉錄效率低，表現為rna質量符合以上要求，內參基因不能正常擴增目的條帶。
1） 建議使用第二種逆轉錄操作步驟。即70℃孵育10分鐘，迅速冰浴2分鐘。再加入逆轉錄酶，42℃孵育50分鐘。70℃孵育15分鐘。
2） 建議使用高階產品super rt逆轉錄酶，對低拷貝的模板逆轉錄效率更高。
1.4若rna量小於50ng，建議加入rna酶抑制劑。
1.5逆轉錄酶的儲存，是否有反覆凍融的情況。
2. 試劑量不夠：
2.1 產品管壁或者管口有液體。
2.2 移液器不准，或者槍頭溶液掛壁嚴重。
解決方案：客戶拿到產品後，應在冰上融解，並短暫離心後，再使用。
螢光定量產品
擴增曲線
內參基因和目的基因均無ct值（訊號）出現或ct值出現過晚
1. 檢測試驗步驟、試劑、體系、程式是否正確。
注意：ultrasybr mixture：熱啟動95度，10分鐘
fastsybr mixture：熱啟動95度，20秒
與寶生物等其他公司產品的熱啟動時間不同，因此建議嚴格按照說明書體系操作。
2. 模板中含有抑制劑、核酸酶、蛋白酶等。不建議使用原液進行螢光定量，應將模板原液進行稀釋後操作。如5倍的梯度稀釋，以確定最佳的樣本濃度。
3. 確定模板的提取質量，模板是否出現降解。
4. 模板量不足，將模板進行梯度稀釋，如5倍的梯度稀釋，以確定最佳的樣本濃度。
內參基因ct值出現正常，但目的基因ct值較晚出現。
1. 內參基因能有效擴增，說明螢光定量試劑沒有問題。
2. 目的基因ct值出現較晚，可能原因為：
1） 目的基因表達量偏低
2）目的基因引物擴增效率低
解決方法：將模板進行梯度稀釋，如5倍的梯度稀釋，以確定引物的擴增效率。引物擴增效
率建議在90%-110%左右。或更換引物，或重新設計引物。
pcr電泳有結果，但是螢光定量pcr沒有擴增曲線和融解曲線。
2.1 檢測試驗步驟、試劑、體系、程式是否正確。
2.2 定量pcr和普通pcr有時會出現結果不一致的現象。若可以重複出螢光定量pcr的結果，結果穩定，建議繼續使用螢光定量pcr結果。
熔解曲線不止乙個主峰
1.1 若在熔解曲線主峰前面出現小峰，並且小峰的tm值在70-80範圍內，很可能是引物二聚體。同時查詢陰性對照。
解決方法：1）降低引物濃度 2）提高退火溫度
1.2 陰性對照有汙染。需檢查試劑、移液器、操作台等。
1.3 模板有基因組的汙染。
解決方法：rna提取過程中避免dna的引入，建議將rna用dnaseⅰ消化，或通過跨內
含子設計引物避免基因組汙染。
1.4高濃度樣本熔解曲線正常，低濃度樣本出現雙峰或多峰。
在低濃度樣本中，模板拷貝數低，因此會出現引物二聚體的現象。
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