血液中乙醇的測定
頂空氣相色譜法
發布中華人民共和國司法部
司法鑑定管理局
前言本標準的附錄a和附錄b為資料性附錄。
本標準由中華人民共和國司法部司法鑑定科學技術研究所提出。
本標準由中華人民共和國司法部歸口。
本標準起草單位：中華人民共和國司法部司法鑑定科學技術研究所。
本標準主要起草人：卓先義、劉偉、向平、沈保華、卜俊、馬棟、嚴慧。
血液中乙醇的測定
頂空氣相色譜法
1 範圍
本標準規定了血液中乙醇的頂空氣相色譜測定方法。
本標準適用於血液中乙醇的定性及定量分析。
本標準的方法檢出限為0.01mg/ml；定量下限為0.05mg/ml。
2 規範性引用檔案
下列檔案中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用檔案，其隨後所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用於本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些檔案的最新版本。凡是不注日期的引用檔案，其最新版本適用於本標準。
gb/t 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法（gb/t 6682-2008，iso 3696：1987，mod）
ga/t 122 毒物分析名詞術語
3 原理
本法利用乙醇的易揮發性，以叔丁醇為內標，用頂空氣相色譜火焰離子化檢測器進行檢測，經與平行操作的乙醇對照品比較，以保留時間或相對保留時間定性，用內標法、峰面積比進行定量分析。
4 試劑和材料
除另有說明外，水為gb/t 6682規定的二級水。
4.1 乙醇
色譜純。
4.2 乙醇標準溶液
精密稱取適量乙醇，用水配成10.0mg/ml乙醇標準儲備溶液。儲備液在冰箱中冷藏密閉儲存，有效期為6個月。
試驗中所用其它濃度的標準溶液均從上述儲備液稀釋而得，在冰箱中冷藏密閉儲存，有效期為3個月。
4.3 叔丁醇
色譜純。
4.4 叔丁醇溶液
精密稱取適量叔丁醇，用水配成5.0mg/ml叔丁醇儲備液。儲備液在冰箱中冷藏密閉儲存，有效期為12個月。
將儲備液用水稀釋，得40.0μg/ml叔丁醇內標工作液，在冰箱中冷藏密閉儲存，有效期為6個月。
5 儀器
5.1 氣相色譜儀
配火焰離子化檢測器(fid)。
5.2 頂空進樣器
配1ml定量進樣環。
5.3 樣品瓶
10ml，頂空自動進樣器用。
5.4 矽橡膠墊。
5.5 鋁帽。
5.6 密封鉗。
5.7 精密移液器。
5.8 自動稀釋儀。
6 測定步驟
6.1 樣品處理
用精密移液器或自動稀釋儀採樣品血0.10 ml及0.50 ml 40.0μg/ml 叔丁醇內標工作液，加入樣品瓶內，蓋上矽橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻。
6.2 測定
6.2.1 頂空氣相色譜測定參考條件
a）色譜柱（1）：db-alc1（30m×0.32mm×1.8μm）石英毛細管柱或相當者；
柱溫：恆溫40°c；
色譜柱（2）：db-alc2（30m×0.32mm×1.2μm）石英毛細管柱或相當者；
柱溫：恆溫40°c；
b）載氣：氮氣，純度≥99.999%，流速8ml/min；
c）進樣口溫度：150°c；
d）檢測器溫度：250°c；
e）加熱箱溫度：65℃；
f）定量環溫度：105℃；
g）傳輸線溫度：110℃；
h）氣相迴圈時間：3.5min；
i）樣品瓶加熱平衡時間：10.0min；
j）樣品瓶加壓時間：0.10min；
k）定量環充滿時間：0.10min；
l）定量環平衡時間：0.05min；
m）進樣時間：1.00min。
6.2.2 定性測定
樣品溶液按照頂空氣相色譜測定條件測定，以叔丁醇為內標，計算色譜峰的相對保留時間，將樣品色譜峰的保留時間（或相對保留時間）與乙醇標準對照品的保留時間（或相對保留時間）比較，相對誤差小於2%，空白對照樣品內標物色譜峰正常而無乙醇的色譜峰，可以認為檢材中含有乙醇。如果內標物
色譜峰正常，而無乙醇的色譜峰時，可認為檢驗結果為陰性。乙醇對照品和內標氣相色譜圖，參見附錄a。
6.2.3 定量測定
本方法採用內標法－校準曲線法或內標法－單點校正法定量測定。
6.2.3.1 內標法－校準曲線法
採用內標-校準曲線法測定（見附錄b）。將乙醇對照品溶液進樣，以乙醇和內標峰面積比為縱座標，乙醇對照品工作溶液濃度為橫座標繪製標準曲線，用標準曲線對樣品進行定量，所測樣品中乙醇的濃度值應**性範圍內。
6.2.3.2 內標法－單點校正法
血液樣品乙醇濃度在標準溶液濃度的±30%內可用單點法定量。
6.3 平行試驗
按以上步驟對同一試樣進行平行試驗。
單柱單檢測器兩份樣品測定結果按兩份樣品的平均值計算，雙樣相對相差不得超過5％（有凝血塊的血樣不超過10％）。雙樣相對相差按式（1）計算：
| c1 - c2|
雙樣相對相差（%） =× 100 (1)
c式中：
c1、c2兩份樣品平行定量測定的結果；
c 兩份樣品平行定量測定結果的平均值(c1+c2)/2。
雙柱雙檢測器兩份樣品測定結果的相對標準偏差rsd（%）若不超過10％時（有凝血塊的血樣不超過15％），結果按兩份樣品結果的平均值計算。
7 結果計算
血液中乙醇濃度測定採用內標法－校準曲線法定量或按式(2)計算：
a× a i′×c
c = (2)
a′×a i
式中：c血液樣品中乙醇濃度，單位為毫克每毫公升(mg/ml)；
a血液樣品中乙醇的峰面積；
a′標準溶液中乙醇的峰面積；
a i′標準溶液中內標物的峰面積；
a i血液樣品中內標物的峰面積；
c標準溶液中乙醇濃度，單位為毫克每毫公升(mg/ml)。
附錄 a
（資料性附錄）
乙醇對照品和內標氣相色譜圖
a.1圖a.1 按色譜柱（1）條件得的乙醇對照品和內標氣相色譜圖a.2 按色譜柱（2）條件得乙醇對照品和內標氣相色譜圖，見圖a.2。
圖a.2 按色譜柱（2）條件得的乙醇對照品和內標氣相色譜圖
附錄 b
（資料性附錄）
校準曲線
配製乙醇濃度為0.10、0.20、0.
50、0.80、1.00、2.
00、3.00mg/ml的水溶液，按6.1和6.
2項下分析，每一濃度點取2份，以乙醇與內標叔丁醇的峰面積比對乙醇濃度做工作曲線。
按色譜柱（1）條件測得的工作曲線方程為x = 1.0761 c - 0.0162（r = 0.
9997），按色譜柱（2）條件測得的工作曲線方程為x = 1.0655 c - 0.0177（r = 0.
9997）。式中x為乙醇與叔丁醇的峰面積比值，c 為乙醇工作溶液濃度(mg/ml)。
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