聚丙烯醯氨凝膠電泳
一簡介作用原理：聚丙烯醯胺凝膠為網狀結構，具有分子篩效應。它有兩種形式：
非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳（native-page）及sds-聚丙烯醯胺凝膠（sds-page）；非變性聚丙烯醯胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態，並依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。而sds-page僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由shapiro於2023年建立，他們發現在樣品介質和丙烯醯胺凝膠中加入離子去汙劑和強還原劑（sds即十二烷基磺酸鈉）後，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決於亞基分子量的大小（可以忽略電荷因素）。
二作用sds是陰離子去汙劑，作為變性劑和助溶試劑，它能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去摺疊，破壞蛋白分子的
二、**結構。而強還原劑如巰基乙醇，二硫蘇糖醇(dtt)能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入還原劑和sds後，分子被解聚成多肽鏈，解聚後的氨基酸側鏈和sds結合成蛋白- sds膠束，所帶的負電荷大大超過了蛋白原有的電荷量，這樣就消除了不同分子間的電荷差異和結構差異。
sds-page一般採用的是不連續緩衝系統，與連續緩衝系統相比，能夠有較高的解析度。濃縮膠的作用是有堆積作用，凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，經過大孔徑凝膠的遷移作用而被濃縮至乙個狹窄的區帶。當樣品液和濃縮膠選tris/hcl緩衝液，電極液選tris/甘氨酸。
電泳開始後，hcl解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在後面形成低電導區，而電場強度與低電導區成反比，因而產生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩定的介面，使蛋白聚集在移動介面附近，濃縮成一中間層。
此鑑定方法中，蛋白質的遷移率主要取決於它的相對分子質量，而與所帶電荷和分子形狀無關。
三電泳過程
蛋白質在聚丙烯醯胺凝膠中電泳時，它的遷移率取決於它所帶淨電荷以及分子的大小和形狀等因素。如果加入一種試劑使電荷因素消除，那電泳遷移率就取決於分子的大小，就可以用電泳技術測定蛋白質的分子量。2023年，shapiro等發現陰離子去汙劑十二烷基硫酸鈉（sds）具有這種作用。
當向蛋白質溶液中加入足夠量sds和巰基乙醇，可使蛋白質分子中的二硫鍵還原。由於十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質—sds複合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，sds與蛋白質結合後，還可引起構象改變，蛋白質—sds複合物形成近似「雪茄菸」形的長橢圓棒，不同蛋白質的sds複合物的短軸長度都一樣，約為18a(1a=10的負十次方公尺），這樣的蛋白質—sds複合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原的電荷和形狀的影響，而取決於分子量的大小由於蛋白質－sds複合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠後，由於聚丙烯醯胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快；大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯後，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。因而sds聚丙烯醯胺凝膠電泳可以用於測定蛋白質的分子量。
當分子量在15kd到200kd之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關係，符合下式：logmw=k-bx，式中：mw為分子量，x為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。
sds－聚丙烯醯胺凝膠電泳經常應用於提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在sds電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應於各個亞基的幾條帶。sds－聚丙烯醯胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關於分子量的情況，這些資訊對於了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。
四操作步驟
所需試劑及儀器：
試劑：丙烯醯胺，雙丙烯醯胺，tris-base，temed，sds，過硫酸銨，甘油，溴酚蘭，甘氨酸，dtt，考馬斯亮藍r-250，甲醇，冰醋酸，蛋白marker5只（50ul裝），小牛血清白蛋白10mg。
儀器裝置：電泳儀、槽、板5套；10ml小燒杯10只，微量移液器5把，普通移液器5套，足量濾紙，0.45μm濾器。
母液：1、2m tris-hcl (ph8.8)100ml：
24.2g tris-base，50ml蒸餾水，加入濃鹽酸調ph8.8，最後定容至100ml。高壓滅菌處理。
2、1m tris-hcl (ph6.8)100ml：
12.1g tris-base，50ml蒸餾水，加入濃鹽酸調ph6.8，最後定容至100ml。高壓滅菌處理。
3、10%sds100ml：
10gsds，加入70ml蒸餾水在60℃攪拌溶解，待泡沫消失後，定容至100ml。
4、50%（w/v）甘油100ml：
50ml甘油，50ml蒸餾水，混勻即可。
5、1%（w/v）溴酚蘭（染色）10ml：
100mg溴酚蘭，蒸餾水定容至10ml。
6、0.01mol/l乙酸鈉溶液100ml：
0.139g乙酸鈉溶於100ml蒸餾水中，調ph至5.2。
7、1m dtt20ml：20ml0.01mol/l乙酸鈉溶液溶解3.09gdtt，過濾除菌後分裝成1ml/份，-20℃儲存。
工作液：
1、30%聚丙醯胺母液（a液）實際需要250ml
100ml：丙烯醯胺29g，雙丙烯醯胺1g，去離子水在37℃溶解，
定容到100ml。0.45μm濾器過濾除菌，棕色瓶儲存。ph≤7.0。
2、4×分離膠緩衝液（b液）100ml：
75ml 2m tris-hcl (ph8.8)
4ml 10%sds
21ml蒸餾水
4℃存放。
3、4×濃縮膠緩衝液（c液）100ml：
50ml 1m tris-hcl (ph6.8)
4ml 10%sds
46ml蒸餾水
4℃存放。
4、10%過硫酸銨（d液）5ml：
0.5g過硫酸銨，5ml蒸餾水，0.1m分裝。
5、temed （e液）
5、1×tris-甘氨酸緩衝液1l：
tris-base 3g
甘氨酸 14.4g
sds 1g蒸餾水定容到1l，ph8.3左右。
6、5×上樣緩衝液10ml：
0.5ml 1m tris-hcl（ph6.8）
1ml 1m dtt
2ml 10% sds
1ml 1%溴酚蘭
5ml 50%甘油
0.5ml 蒸餾水
7、考馬斯亮藍染色液1l：
考馬斯亮藍r-250 1.0g
甲醇450ml
冰醋酸 100ml
蒸餾水450ml
8、考馬斯亮藍脫色液1l：
甲醇100ml
冰醋酸 100ml
蒸餾水800ml
步驟：一、組裝模具：
用海綿蘸取少量清潔劑，擦洗乾淨兩塊玻璃板，自來水沖洗3—5遍然後，再用無水乙醇沖洗2遍，晾乾待用。將已清洗乾淨的兩塊玻璃板用封條封嚴。組裝在電泳架上，淺玻璃板朝外（靠近操作者一側），然後固定結實。
（注意：清洗玻璃板時動作要輕柔，切勿劃破玻璃面；清洗乾淨之後，不要用手碰玻璃面。）
二、制膠：
1、配10%分離膠10ml：吸取a液3.3ml，b液2.
5ml，蒸餾水4.2ml，d液100μl，在小燒杯中搖勻，再加入e液10μl，立即混勻並用10ml注射器吸取大約8ml混合溶液，沿著玻璃板之間縫隙左上處，緩慢灌膠，一直到距前玻璃板上沿1.5cm處為止。
（注意：a當凝膠完全浸沒玻璃板底的時候，留意觀察是否漏膠。若漏膠，則立即停止灌膠，重新固定模具之後再繼續。
b灌膠應緩慢進行，避免有氣泡產生）
2、水膜封閉空氣：在分離膠上面小心加入一層蒸餾水，以隔絕空氣，促進凝膠聚合。等待約20—30min，交介面有明顯的折光線，且傾斜模具，交介面不隨之改變，為凝膠凝固良好。
用濾紙小心洗乾水分。
3、配5%濃縮膠5ml：吸取a液0.67ml，c液1.0ml，蒸餾水2.3ml，d液50μl，在小燒杯中搖勻，再加入e液5μl，立即混勻，灌膠，到到前玻璃板上沿即可。
4、插上齒梳，確保無氣泡。等待凝膠完全聚合，約需30分鐘。
5、小心拔出梳子，卸下封條，將玻璃板顛倒放置，使淺玻璃板朝內，固定在電泳架上。將整個電泳架放入電泳槽，在內外槽中倒入電泳緩衝液，內槽液面應在前後玻璃板之間。
三、點樣：
1、吸取20μl蛋白樣品到ep管中，加入4μl上樣緩衝液，混勻，沸水中加熱5min
2、全部樣品上樣，小心不要使樣品漂散。
3、同時吸取蛋白marker10—20μl點樣。
四、電泳：連線好正負極導線，穩壓120v，至溴酚蘭到達分離膠底部。
倉庫操作規範
盤庫操作要求 1.在盤庫之前所有發料人員物料與倉庫明細賬統一截止發料日期。2.在盤庫之前各發料人員在物料與倉庫明細賬統一截止發料日期的基礎上，認真核對各自所發物料是否與明細賬數量一致。3.倉庫記賬人員在物料截止日期規定時間內，根據明細賬數目抄錄在 庫存材料盤庫表 上交財務部門。表如下 4.其中 庫存...
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