第十七章細胞增生和凋亡相關基因與疾病
原癌基因（proto-oncogene)是一類廣泛存在生物體中，高度保守的基因，其產物具有調控細胞增生的重要功能，當其受某些因素的影響，能發生突變（活化）成為癌基因，導致細胞惡性轉化。
原癌基因的特點：1、廣泛存在於生物體；2、高度保守，功能相似；3、產物有重要功能；4、某些因素作用下，可發生突變，使細胞惡性轉化。
原癌基因的產物：是訊號轉導途徑及基因轉錄的關鍵分子。生長因子、生長因子受體、非受體洛氨酸蛋白激酶、g蛋白。
原癌基因的活化機制：1、點突變2、基因擴增3、基因重排4、染色體易位5、插入誘變
癌基因的功能：
1、轉化（transformation)細胞形態發生變化，持續增生。調控轉化的原癌基因產物主要是位於細胞及胞漿。2、永生化（immortalization) 細胞分化受阻，不衰老死亡。
調控永生化的原癌基因產物主要是位於細胞核內的轉錄因子。
抑癌基因（tumor suppressor gene）：指存在於正常細胞內的一大類可抑制細胞生長並具有潛在抑癌作用的基因，當這類基因發生突變、缺失或失活時，可引起細胞惡性轉化而導致腫瘤的發生。
抑癌基因的作用：1、rb和p53調節細胞週期關卡2、調節訊號轉導抑制細胞增生3、促進dna修復維持基因組穩定
轉基因動物的製備基本步驟：將目的基因（或基因組片段）匯入實驗動物的受精卵（或著床前胚胎細胞），然後將其植入受體動物的輸卵管或子宮中，發育成攜帶有外源基因的個體，並通過分析其基因組中外源基因的整合狀況及其揭示外源基因功能的表型，在此基礎上經過常規的遺傳育種方法培育出轉基因動物。
轉基因動物的應用：1、確定特定基因的功能 2、發現新基因功能 3、發現新基因（突變） 4、研究基因表達的時空性 5、建立動物模型 6、產生需要的器官或組織
基因敲除（gene knockout）：指通過dna同源重組定向地將外源基因替換宿主細胞染色體dna中特定的基因，從而使特定的基因在細胞內或生物體內失活的過程1打靶載體的構建：同源序列要足夠長，要含有篩選用的標誌基因。
2基因敲除動物（gene knockout animal）：採用同源重組定向剔除特定基因的技術，所製備的某特定基因喪失功能的動物。基因敲除小鼠：
應用基因敲除技術，使兩條染色體上特定等位基因都喪失功能的小鼠。
基因表達的抑制或沉默是通過在rna水平的干涉來分析特定基因功能的方法。（1）反義rna封閉目標rna的功能
（2）rna干涉（rna interference, rnai使特定基因沉默。
反義rna（antisence rna)：能與mrna互補配對的rna分子。兩種方法：1、人工合成反義rna匯入細胞抑制mrna 2、構建載體匯入細胞轉錄反義rna 抑制mrna
rna干涉是指由短雙鏈rna誘導的同源mrna的降解過程，可使基因表達受到抑制。原理： 雙鏈rna 啟用dicer（
酶複合物，由核酸內切酶和解旋酶組成），識別異常的雙鏈rna並將其切割成短雙鏈rna（sirna，21-23bp）， sirna與dicer結合形成rna誘導沉默複合物（risc），雙鏈rna經解旋酶作用，成為單鏈rna，識別並結合靶rna分子，致核酸內切酶的切割，失去編碼蛋白質的功能。兩個步驟：1、長雙鏈rna成為小干涉性rna （sirna); 2、risc形成，識別sirna同源的mrna ，並切割。
選擇目標rna干涉靶點的注意點：1、避開蛋白結合部位，選擇aug下游50-100bp區的aa（n19）tt或aa（n21）序列；2、gc比50%左右，長30nt；
3、與其它rna序列無同源性。
主要步驟：1、確定目標rna 並選擇被干涉靶點；2、準備針對目標rna的sirna；3、用sirna干涉目標rna;4、目標rna含量和蛋白質水平的分析。
第十三章
基因工程
dna 重組（dna recombination）：不同**的dna分子通過共價連線（磷酸二酯鍵）而組合成新的dna分子，這一過程稱為dna重組。重組dna技術又稱為分子轉殖技術或基因工程技術。
分子轉殖：在體外對dna分子按照既定目的和方案進行人工重組，將重組分子匯入宿主，使其在宿主中擴增和繁殖，以獲得該dna分子的大量拷貝。
基因工程(genetic engineering)：有目的地通過分子轉殖技術，利用轉殖基因表達、製備特定的蛋白或多肽產物，或定向改造基因結構所用的方法及相關的工作統稱為基因工程。
基因工程的研究內容：1.目的基因的獲取：
從生物有機體的基因組中分離帶有目的基因的dn**段；2.重組：在體外將帶有目的基因的dn**段連線到能自我複製並具有選擇標誌的載體分子上，形成重組分子；3.
將重組分子匯入受體細胞（細菌）:k-12。4.
帶有重組子的細菌擴增，獲得大量的繁殖群體。5.篩選：
從大量的細胞繁殖群體中篩選出帶有重組dna分子的轉殖。6.分析和表達：
將選出的細胞轉殖的目的基因進行進一步分析並實現功能蛋白的表達
分子轉殖常用的工具酶：一、限制性核酸內切酶：是細菌產生的一類能識別和切割雙鏈dna分子內特定的鹼基順序的核酸水解酶。
分類：可分為ⅰ、ⅱ、ⅲ型三大類。ⅱ型酶作用特點：
只有限制性活性，無甲基化活性；只需mg++作為催化反應輔助因子，無須ａｔｐ。識別順序一般為4～6個鹼基，通常是回文結構（反轉重複順序），即具有180°的旋轉對稱。二、dna連線酶（dna ligase）：
t4 dna ligase。催化兩個獨立雙鏈dn**段5』-磷酸基和3』-羥基之間形成磷酸二酯鍵；修復雙鏈dna中一條鏈上的缺口。三、dna聚合酶（dna polymerase）1、dna polymerase i （全酶，kornberg polymerase）具有至少3種活性：
5』3』聚合酶活性；5』
3』外切酶活性；3』
5』外切酶活性。應用：1、催化dna缺口平移（nick translation）反應，製備高比活dna探針；2.
第二cdna鏈合成3. 對雙鏈dna3』突出末端進行末端標記；4. sanger 測序
2、大腸桿菌dna聚合酶ⅰklenow片段：5』3』聚合酶；3』
5』外切酶；缺失5』3』外切酶活性
應用：全酶第2-4。四、逆轉錄酶
（reverse transcriptase）依賴於rna的dna聚合酶，這是一種有效的轉錄rna成為dna的酶，產物dna又稱cdna（complementary dna）。用於mrna為模板合成cdna，是構建cdna文庫和rt-pcr技術中的關鍵工具酶。五、末端脫氧核糖核酸轉移酶（tdt）:
將dntp加到dna3』羥基。作用：①3』端標記dna探針②在載體和待轉殖片段上形成同聚物尾，以利dna重組。
六、鹼性磷酸酶（ap）：
催化去除dna、rna、ntp及dntp的5』磷酸基團。1. 在用32p標記5』末端前，去除dna或rna的5』磷酸基；2.
在連線反應中，去除載體dn**段5』磷酸基，防止自身環化。
載體(vector)能在連線酶作用下和外源dn**段連線並運送dna分子進入受體細胞的dna分子
良好的載體應具備以下條件：1. 必須有自身的複製子；2.
載體分子上必須有限制性內切酶酶切位點,即多轉殖位點（multicloning site,mcs），以供外源dna插入3. 載體應具有可供選擇的遺傳標誌，以區別陽性重組子和陰性重組子； 4. 載體分子必須具有足夠的容量5.
可通過特定的方法匯入宿主(氯化鈣，磷酸鈣，電擊，等)。6. 對於表達載體還應配備與宿主細胞相適應的啟動子，前導順序，增強子，加尾訊號等調控dna元件。
一、質粒載體：小片段dna轉殖，測序。特點1、分子量相對較小，能在細菌內穩定存在，有較高的拷貝數。
2、具有乙個以上的遺傳標記，便於對宿主細胞進行選擇，如抗生素的抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lac z）等。3、具有多個限制性內切酶的單一切點，便於外源基因的插入。如果在這個位點有外源基因的插入，會導致某種標誌基因的失活，而便於篩選。
二、噬菌體載體：構建基因文庫（shotgun 基因組文庫、cdna文庫）及
表達文庫。λdna可以作為載體，通過替換自身序列的方式攜帶外源dna，這種載體稱為替換型載體
三、粘性質粒適合轉殖較大的dn**段：由質粒和λ噬菌體的cos粘性末端構建而成。粘粒載體大小為4-6kb，插入片段則可大至29-50kb．應用於大分子量dna轉殖。
特點：①含有質粒的抗藥性標記如ampr基因。②帶有λ噬菌體的粘性末端（cos區）③具有乙個或多個限制性內切酶的酶切位點。
④粘性質粒本身不大⑤非重組體粘粒很小，不能在體外包裝，因而重組體的本底很低，有利於篩選。
四、m13 噬菌體載體：製備單鏈dna, 人工誘變
五、病毒載體可將外源dna帶入哺乳動物細胞
六、bac ：大片段dna 轉殖，0.1-0.4 mb。構建物理圖譜
基因工程的操作程式：一、製備目的基因和相關載體：1、從基因組文庫分離篩選基因。
2、通過cdna文庫分離篩選基因。3、人工合成基因：根據核苷酸序列。
4、pcr擴增目的基因: 已知基因序列或同源序列。載體：
λ噬菌體和粘性質粒適用於構建基因組文庫，puc系列質粒適合構建cdna文庫和轉殖一些較小的dn**段，m13噬菌體則適用於轉殖一些待測序的dn**段。二、將目的基因和有關載體進行連線：1、粘性末端最適合dn**段連線；2、人工接頭用於處理不易連線的dn**段；3、加入同聚物尾是處理不易連線的dn**段的另一有效方法；4、平端dn**段可以在t4dna連線酶的作用下，與某些限制性內切酶產生的平端載體相連線。
三、將重組的dna匯入受體細胞：1、轉化是直接將dna匯入\細菌的方法；2、感染是利用噬菌體將外源dna匯入宿主細胞的方法；3、轉染是將外源dna匯入真核細胞的方法。四、dna重組體的篩選和鑑定：
1、採用遺傳學方法可以篩選特定的重組dna：①利用抗性標記可篩選帶有載體的細菌轉殖②利用不同標記可篩選出帶有重組體的細菌轉殖。a、插入滅活法利用特定抗性基因的失活進行篩選；b、-互補篩選是利用功能互補的基因片段。
2、免疫學方法是利用特異性抗體檢測表達產物3、核酸雜交法適合從文庫中篩選特定的dna 4、pcr技術可對特定的dna進行直接鑑定；5、酶切鑑定是利用限制性酶酶切圖譜鑑定特定的dna。五、dna重組體的擴增、表達和其他研究
獲取目的基因的方法：
基因組文庫：是含有某種生物體全部基因的隨機片
段的重組dna轉殖群體，它象乙個儲存有基因組全
部序列的資訊庫，稱為基因組文庫。
cdna文庫：一群含重組cdna的細菌或噬菌體轉殖群體，含有某種生物的全部的mrna的資訊。
轉化：質粒dna或以它為載體構建的重組dna匯入處於感受態的宿主菌並使其獲得新的表型的過程
感染：以噬菌體、粘性質粒和真核細胞病毒為載體的重組dna分子，在體外經過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當的細胞，並在細胞內擴增。
轉導：指以噬菌體為載體，在細菌之間轉移dna的過程，有時也指在真核細胞之間通過逆轉錄病毒轉移和獲得細胞dna的過程。
轉染：指病毒或以它為載體構建的重組子匯入真核細胞的過程。
藍白篩選原理：某些質粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段，在半乳糖苷酶基因的基因區外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的dna序列。這些位點上如果沒有轉殖外源性dn**段，在質粒被匯入lac-的大腸桿菌後，質粒攜帶的半乳糖苷酶基因將正常表達，與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補，產生有活性的半乳糖苷酶，加入人工底物x-gal和誘導劑iptg後，出現藍色的菌落。
如果在多轉殖位點上插入外源dn**段，將使lac z基因滅活，不能生成半乳糖苷酶，結果菌落出現白色。由於這種顏色標誌，重組轉殖和非重組轉殖的區分一目了然。
大腸桿菌體系中表達外源基因所必須具備的條件①要求外源基因的編碼區不能含有內含子②表達的外源片段要位於大腸桿菌啟動子的下游，並形成正確的閱讀框架（orf）③轉錄出的mrna中必須有能與16s核醣體rna3』端相匹配的sd序列，才能被有效翻譯成蛋白質。④蛋白產物必須比較穩定（不易被細胞內的蛋白酶快速降解），且對宿主無害。
原核表達系統（大腸桿菌系統）影響外源基因表達的因素①啟動子的強弱；②基因的劑量；③影響rna轉譯效率的因素:sd atg mrna ④外源基因密碼子的選擇；⑤表達產物的大小；⑥表達產物的穩定性。
分子生物學
清道夫細胞 處理氧化修飾了的膽固醇，不具備膽固醇轉化作用，最終導致膽固醇細胞破裂。2 逆轉錄 以病毒rna為模板，指導含有全部病毒資訊的dna合成過程。3 細胞凋亡 在基因程式性控制下有別於細胞壞死的一種，有規律的自我消亡。4 dna的c值 同種生物基因組dna含量是恆定的，乙個單倍體基因組中的dn...
分子生物學
第一章緒論 一 dna的發現 1928年英國科學家griffith等人發現肺炎鏈球菌使小鼠死亡的原因是引起肺炎。首先用實驗證明基因就是dna分子的是美國著名的微生物學家 ery。1952年，美國冷泉港卡耐基遺傳學實驗室科學家hershey和他的學生chase從事噬菌體侵染細菌的實驗。二 分子生物學簡...
分子生物學
一 名詞解釋 1 基因 能夠表達和產生蛋白質和rna的dna序列，是決定遺傳性狀的功能單位。2 基因組 細胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質的總和。3 端粒 以線性染色體形式存在的真核基因組dna末端都有一種特殊的結構叫端粒。該結構是一段dna序列和蛋白質形成的一種複合體，僅在真核細胞染色體末端存...