實驗器材
牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基配製
牛肉膏 0.3g
蛋白腖 1g
氯化鈉 0.5g
瓊脂 2g
自來水 100ml
ph 7.0~7.2
滅菌 1.05kg/cm2,22min
配製具體步驟
1.稱量
按培養基配方比例依次準確地稱取牛肉膏、蛋白腖、nacl放入燒杯中。牛肉膏常用玻棒挑取,放在小燒杯或表面皿中稱量,用熱水溶化後倒入燒杯。也可放在稱量紙上,稱量後直接放入水中,這時如稍微加熱,牛肉膏便會與稱量紙分離,然後立即取出紙片。
蛋白腖很易吸潮,在稱取時動作要迅速。另外,稱藥品時嚴防藥品混雜,一把牛角匙用於一種藥品,或稱取一種藥品後,洗淨、擦乾,再稱取另一藥品,瓶蓋也不要蓋錯。
2.溶化
在上述燒杯中可先加入少於所需要的水量,用玻棒攪勻,然後,在石棉網上加熱使其溶解。待藥品完全溶解後,補充水分到所需的總體積。如果配製固體培養基,將稱好的瓊脂放入已溶化的藥品中,再加熱溶化,在瓊脂溶化的過程中,需不斷攪拌,以防瓊脂糊底使燒杯破裂。
最後補足所失的水分。
3.調ph
在未調ph前,先用精密ph試紙測量培養基的原始ph值,如果ph偏酸,用滴管向培養基中逐滴加入1mol/l naoh,邊加邊攪拌,並隨時用ph試紙測其ph值,直至ph達7.6。反之,則用1mol/l hcl進行調節。注意ph值不要調過頭,以避免**,否則,將會影響培養基內各離子的濃度。
對於有些要求ph值較精確的微生物,其ph的調節可用酸度計進行(使用方法,可參考有關說明書)。
4.過濾
趁熱用濾紙或多層紗布過濾,以利結果的觀察。一般無特殊要求的情況下,這一步可以省去(本實驗無需過濾)。很多都是不需要過濾的。
5.分裝
按實驗要求,可將配製的培養基分裝入試管內或三角燒瓶內。分裝裝置見圖ⅴ-1。
分裝過程中注意不要使培養基沾在管口或瓶口上,以免沾汙棉塞而引起汙染。
(1)液體分裝分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。
(2)固體分裝分裝試管,其裝量不超過管高的1/5,滅菌後製成斜面,如圖ⅴ-2。分裝三角***量以不超過三角燒瓶容積的一半為宜。
(3)半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜,滅菌後垂直待凝。
6.加塞
培養基分裝完畢後,在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞,以阻止外界微生物進入培養基內而造成汙染,並保證有良好的通氣效能(棉塞製作方法附本實驗後面)。
7.包紮
加塞後,將全部試管用麻繩捆紮好,再在棉塞外包一層牛皮紙,以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞,其外再用一道麻繩扎好。用記號筆註明培養基名稱、組別、日期。三角燒瓶加塞後,外包牛皮紙,用麻繩以活結形式扎好,使用時容易解開,同樣用記號筆註明培養基名稱、組別、日期。
8.滅菌
將上述培養基以1.05kg/cm2(15磅/英吋2),121.3℃, 20分鐘高壓蒸汽滅菌。如因特殊情況不能及時滅菌,則應放入冰箱內暫存。
9.擱置斜面
將滅菌的試管培養基冷至50℃左右,將試管棉塞端擱在玻棒上,擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。
10.無菌檢查
將滅菌的培養基放入37℃的溫室中培養24—48小時,以檢查滅菌是否徹底。
1.活材料:蘇雲金芽孢桿菌(bacillus thuringiensis)菌劑。
2.培養基:牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基(附錄三、1)
3.器材:90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。
四、實驗方法
1.樣品稀釋液的製備準確稱取待測樣品l0g,放入裝有90ml無菌水並放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置搖床上振盪20min,使微生物細胞分散,靜置20-30s,即成10-1稀釋液;再用1ml無菌吸管,吸取10-1稀釋液lml,移入裝有9ml無菌水的試管中,吹吸3次,讓菌液混合均勻,即成10-2稀釋液;再換一支無菌吸管吸取10-2稀釋液1ml,移入裝有9ml無菌水的試管中,也吹吸三次,即成l0-3稀釋液;以此類推,連續稀釋,製成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀釋菌液(圖22-1)。
圖22-1 平板計數法中樣品的稀釋和稀釋液的取樣培養
用稀釋平板計數時,待測菌稀釋度的選擇應根據樣品確定。樣品中所含待測菌的數量多時,稀釋度應高,反之則低。通常測定細菌菌劑含菌數時,採用10-7、10-8、10-9稀釋度,測定土壤細菌數量時,採用10-4、10-5、10-6稀釋度,測定放線菌數量時,採用l0-3、10-4、10-5稀釋度,測定真菌數量時,採用10-2、10-3、10-4稀釋度。
2.平板接種培養平板接種培養有混合平板培養法和塗抹平板培養法兩種方法。
(1)混合平板培養法將無菌平板編上10-7、10-8、10-9號碼,每一號碼設定三個重複,用無菌吸管按無菌操作要求吸取10-9稀釋液各1ml放入編號10-9的3個平板中,同法吸取10-8稀釋液各lml放入編號10-8的3個平板中,再吸取10-7稀釋液各lml放入編號10-7的3個平板中(由低濃度向高濃度時,吸管可不必更換)。然後在9個平板中分別倒入已融化並冷卻至45—50℃的細菌培養基(圖22-2),輕輕轉動平板,使菌液與培養基混合均勻,冷疑後倒置,適溫培養。至長出菌落後即可計數。
(2)塗抹平板計數法塗抹平板計數法與混合法基本相同,所不同的是先將培養基熔化後趁熱倒入無菌平板中,待凝固後編號,然後用無菌吸管吸取0.1ml菌液對號接種在不同稀釋度編號的瓊脂平板上(每個編號設三個重複)。再用無菌刮鏟將菌液在平板上塗抹均勻(圖22-3),每個稀釋度用乙個滅菌刮鏟,更換稀釋度時需將刮鏟灼燒滅菌。
在由低濃度向高濃度塗抹時,也可以不更換刮鏟。將塗抹好的平板平放於桌上20—30min,使菌液滲透入培養基內,然後將平板倒轉,保溫培養,至長出菌落後即可計數。
三、實驗器材
1.活材料:你的材料
2.培養基:牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基(附錄三、1)
3.器材:90ml無菌水、9ml無菌水、無菌平皿、lml無菌吸管、天平、稱樣瓶、記號筆、玻璃刮鏟等。
高氏1號培養基是分離和培養放線菌的合成培養基。這種培養基是由可溶性澱粉(作為碳源),kno3(作為氮源),nacl、k2hpo4·3h2o、mgso4·7h2o(作為無機鹽,為微生物提供鈉、鉀、磷、鎂、硫等離子)和feso4· 7h2o(作為微生物的微量元素,提供鐵離子)等組成。由於磷酸鹽和鎂鹽相混合時產生沉澱,因此,在混合培養基成分時,一般是按配方的順序依次溶解各成分。
對於象feso4·7h2o這樣的微量成分,則可預先配成高濃度的貯備液,在配製培養基時按需要加入一定的量。
高氏1號培養基配方如下:
可溶性澱粉 20g
nacl 0.5g
kno3 1g
k2hpo4·3h2o 0.5g
mgso4· 7h2o 0.5g
feso4·7h2o 0.01g
瓊脂 15—20g
水 1000ml
ph 7.4—7.6
三、器材
可溶性澱粉,kno3,nacl,k2hpo4·3h2o,mgso4·7h2o, feso4·7h2o,瓊脂, 1mol/l naoh, 1mol/ lhcl;
試管,三角燒瓶,燒杯,量筒,玻棒,培養基分裝器,扭力天平,牛角匙,高壓蒸汽滅菌鍋,ph試紙(ph5.5—9.0),棉花,牛皮紙,記號筆,麻繩,紗布等。
四、操作步驟
1.稱量和溶化
按配方先稱取可溶性澱粉,放入小燒杯中,並用少量冷水將澱粉調成糊狀,再加入少於所需水量的沸水中,繼續加熱,使可溶性澱粉完全溶化。再稱取其他各成分依次逐一溶化。對微量成分feso4·7h2o可先配成高濃度的貯備液後再加入,方法是先在100ml水中加入1g的feso4·7h2o配成0.01g/ml,再在1000ml培養基中加入1ml的0.01g/ml的貯備液即可。
待所有藥品完全溶解後,補充水分到所需的總體積。
馬丁氏培養基是一種用來分離真菌的選擇性培養基。此培養基是由葡萄糖、蛋白腖、kh2po4、mgso4·7h2o、孟加拉紅(玫瑰紅,rose bengal)和鏈黴素等組成。其中葡萄糖主要作為碳源,蛋白腖主要作為氮源,kh2po4和mgso4·7h2o作為無機鹽,為微生物提供鉀、磷和鎂離子。
而孟加拉紅和鏈黴素主要是細菌和放線菌的抑制劑,對真菌無抑制作用,因而真菌在這種培養基上可以得到優勢生長,從而達到分離真菌的目的。
馬丁氏培養基配方如下:
kh2po4 1g
mgso4·7h2o 0.5g
蛋白腖 5g
葡萄糖 10g
瓊脂 15-20g
用蒸餾水定容至1000ml
此培養液1000ml加1%孟加拉紅水溶液3.3ml。
由於鏈黴素受熱容易分解,所以臨用時,將培養基溶化後待溫度降至45℃左右時才能加入。可先將鏈黴素配成1%的溶液,在100ml培養基中加1%鏈黴素液0.3ml,使每毫公升培養基中含鏈黴素30μg。
後面的步驟都是差不多的。像這些培養微生物的方法,只是在培養基的培製上有一點區別,其它方面都是差不多的。
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