mtt實驗
原理；步驟；
注意事項；
一、原理
mtt全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍。是一種黃顏色的染料。
mtt比色法，是一種檢測細胞存活和生長的方法。其檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性mtt還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚（formazan）並沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞碸（dmso）能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。
在一定細胞數範圍內，mtt結晶形成的量與細胞數成正比。該方法已廣泛用於一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。它的特點是靈敏度高、經濟。
缺點：由於mtt經還原所產生的甲瓚產物不溶於水，需被溶解後才能檢測。這不僅使工作量增加，也會對實驗結果的準確性產生影響，而且溶解甲的有機溶劑對實驗者也有損害。
mtt 溶液的配製方法：通常，此法中的mtt 濃度為5mg/ml。因此，可以稱取mtt 0.
5克，溶於100 ml的磷酸緩衝液（pbs）或無酚紅的培養基中，用0.22μm濾膜過濾以除去溶液裡的細菌，放4℃ 避光儲存即可。在配製和儲存的過程中，容器最好用鋁箔紙包住。
實驗的時候我一般關閉超淨台上的日光燈來避光，覺得這樣比較好。
需要注意的是，mtt法只能用來檢測細胞相對數和相對活力，但不能測定細胞絕對數。在用酶標儀檢測結果的時候，為了保證實驗結果的線性，mtt 吸光度最好在0-0.7 範圍內。
mtt一般最好現用現配，過濾後4ºc避光儲存兩周內有效，或配製成5mg/ml儲存在-20度長期儲存，避免反覆凍融，最好小劑量分裝，用避光袋或是黑紙、錫箔紙包住避光以免分解。我一般都把mtt粉分裝在ep管裡，用的時候現配，直接往培養板中加，沒必要一下子配那麼多,尤其當mtt變為灰綠色時就絕對不能再用了。
mtt有致癌性，用的時候小心,有條件最好帶那種透明的簿膜手套.配成的mtt需要無菌，mtt對菌很敏感；往96孔板加時不避光也沒有關係，畢竟時間較短，或者你不放心的時候可以把操作台上的照明燈關掉.
配製mtt時用pbs（ph=7.4）溶解。
pbs配方：nacl 8g ＋ kcl 0.2g ＋ na2hpo4 1.44g ＋ kh2po4 0.24g調ph 7.4,定容1l。
二、幾種mtt法實驗步驟
普通mtt法實驗步驟：
1：接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞（細胞濃度的問題見後面的注意事項）接種到96孔板，每孔體積200ul.
2: 培養細胞：同一般培養條件，培養3-5天（可根據試驗目的和要求決定培養時間）。
3：呈色：培養3-5天後，每孔加mtt溶液（5mg/ml用pbs配製，ph=7.
4)10ul.繼續孵育4 h，終止培養，小心吸棄孔內培養上清液，對於懸浮細胞需要離心後再吸棄孔內培養上清液。每孔加100ul dmso，振盪10min，使結晶物充分融解。
4：比色：選擇490nm波長，在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值，記錄結果，以時間為橫座標，吸光值為縱座標繪製細胞生長曲線
藥物mtt法實驗步驟
（1）貼壁細胞：
1: 收集對數期細胞，調整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調密度1000- 10000 /孔，（細胞濃度的問題見後面的注意事項）。
2: 5%co2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底（96孔平底板）,加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁後即可加藥，或兩小時，或半天時間，但我們常在前一天下午鋪板，次日上午）加藥.一般5-7個梯度,每孔100ul,設3-5個復孔.
建議設5個，否則難以反應真實情況
3: 5%co2，37℃孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
4: 每孔加入10ulmtt溶液（5mg/ml，即0.5%mtt），繼續培養4h。
若藥物與mtt能夠反應，可先離心後棄去培養液，小心用pbs衝2-3遍後，再加入含mtt的培養液。
5: 終止培養，小心吸去孔內培養液。
6: 每孔加入100ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值。
7: 同時設定調零孔（培養基、mtt、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、mtt、二甲基亞碸）。
（2）懸浮細胞：
1: 收集對數期細胞，調節細胞懸液濃度1×106/ml（細胞濃度的問題見後面的注意事項），按次序將①補足的1640（無血清）培養基40ul ；②加actinomycin d（有毒性）10ul用培養液稀釋 (儲存液100mg/ml，需預試尋找最佳稀釋度，1:10-1:
20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（邊緣孔用無菌水填充）。每板設對照（加100ml 1640）
2: 置37℃，5%co2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。
3: 每孔加入10 ul mtt溶液（5 mg/ml，即0.5%mtt），繼續培養4 h。
（懸浮細胞推薦使用wst-1，培養4 h後可跳過步驟4），直接酶聯免疫檢測儀od570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值）
4、離心（1000轉x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亞碸，置搖床上低速振盪10 min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀od570nm（630nm校準）測量各孔的吸光值。
5、同時設定調零孔（培養基、mtt、二甲基亞碸），對照孔（細胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養液、mtt、二甲基亞碸），每組設定3復孔。
三、注意事項：
(1) 選擇適當得細胞接種濃度和培養時間。
一般情況下，96孔培養板的一內貼壁細胞長滿時約有105個細胞。但由於不同細胞貼壁後面積差異很大，因此，在進行mtt試驗前，要進行預實驗檢測其貼壁率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，確定試驗中每孔的接種細胞數和培養時間，以防止細胞過滿。這樣，才能保證mtt結晶形成的量與細胞數呈的線性關係。
否則細胞數太多敏感性降低，太少觀察不到差異。因此，很多高手總結出「寧少勿多」的原則，這一原則在大多數情況下是適用的。
對於體積大，增殖快的細胞，比如腫瘤細胞，在96孔板中不能接種太多數目的細胞。一般應該少於104個/孔。同時，細胞貼壁後不可培養過久，以防過於密集。
大多數腫瘤細胞最佳點板濃度在4000-5000/孔，太少的話sd值會很大。
對於體積小，增殖慢、懸浮的細胞，在96孔板中可以接種更多數目的細胞。甚至可以超過105個/孔。同時，為了觀察藥物對這類細胞的效果，可以較上一種細胞培養更長時間。
在做腫瘤細胞的時候，往往要根據細胞生長速度以及藥物的特性(有時間依賴性和濃度依賴性的藥物)來確定培養時間是48小時還是72小時.
(2) 設定調零孔（只加培養基100ul、mtt10ul、二甲基亞碸100ul）。
(3) 設定空白孔（細胞、藥物溶解介質、培養液共100ul、10ulmtt 、100ul二甲基亞碸）。
(4) mtt實驗吸光度最後要在0-0.7之間，超出這個範圍就不是直線關係。
(5) 96孔板邊緣32孔用無菌pbs填充,因為邊緣的32孔中水分蒸發很快，藥物易被濃縮，對實驗影響大。同時加入pbs液填充後，可以一定程度上保持中間孔的水分。
(6)防止藥物與mtt反應。
如果96孔板中加入了具有氧化還原性的藥物，比如穀胱甘肽、vit e、vitc，那建議你用pbs將細胞洗洗，否則這些藥物會將mtt還原成棕褐色沉澱，這種效果可能是你不需要的。
(7) 吸收值分析
在理想的mtt實驗中，如果是細胞抑制實驗，不加藥物處理的空白組的吸收值應該在0.8-1.2左右，太小檢測誤差佔的比例較多，太大吸收值可能已經超出線性範圍。
這個原理在朗伯-比爾定律中有解釋。
(8)培養過程中換液
100ul的培養液對於10的4～5次方的增殖期細胞來說，很難維持50h以上，如果營養不夠的話，細胞會由增殖期漸漸趨向g0期而趨於靜止，影響結果。如果培養時間長，在48h應該換液一次。
(9) 避免血清干擾
高的血清物質會影響試驗孔的光吸收值。由於試驗本底增加，會試驗敏感性。因此，一般選小於10％胎牛血清的培養液進行。在呈色後，盡量吸淨培養孔內殘餘培養液。
(10)判斷汙染
如加入mtt後都有個別孔立即變為藍黑色，則汙染的可能性極大。在加mtt前可以先在鏡下觀察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是臨近的。
(11)加dmso前要把液體小心吸掉
實驗操作步驟和注意事項
1 全開實驗裝置主管道上所有閥門 閥2 閥4 閥5和閥10 全關倒u型差壓計上的閥門，將流向轉換器的出口轉向排水側，開啟管道幫浦。2 孔板流量計的標定 2.1開啟管道幫浦約5分鐘後，關閉閥4 閥10，開啟與孔板流量計相連的倒u型差壓計9上的閥門a2 b2和d2 當a2 b2和d2的手柄處於水平位置時...
裝修步驟和注意事項
裝修步驟 1前期設計 2主體拆改 3水電改造 4木工 5貼磚 6刷牆面漆 7廚衛吊頂 8櫥櫃安裝 9木門安裝 10地板安裝 11鋪貼桌布 12散熱器安裝 13開關插座安裝 14燈具安裝 15五金潔具安裝 16窗簾桿安裝 17拓荒保潔 18家具進場 19家電安裝 20家居配飾 一 前期設計 主要是根據...
觀測步驟及注意事項
第一大組的觀測步驟規範及其注意事項 鄔雪江2011.7 一 gps觀測步驟 1 架設gps儀器，對中 整平 精平 檢查對中情況如果對中良好則可行，反之反覆前面操作一定要確保對中良好。架好儀器後打 通知大組長。2 開關機要聽從大組長的統一安排。3 開機前，要量取天線高三個方向 即是三個腳架所夾的方向 ...