1 外周血白細胞計數實驗
1.1原理
外周血白細胞數減少是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現之一,在一定範圍內,照射劑量與外周血中白細胞數成反比,恢復時間與外周血中白細胞數成正比,外周血中白細胞數可代表血液系統受損的狀況。具有輻射危害輔助保護作用的受試物對受輻射損傷機體的血液系統具有防護作用。
1.2儀器和試劑
20μl定量取血管、血球計數板、顯微鏡、1%鹽酸等。
1.3實驗方法
1.3.1 實驗動物:小鼠,18-22g,單一性別,每組10-15只。
1.3.2 劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和乙個輻射模型對照組,以人體推薦量的10倍為其中的乙個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品於照射前給予14-30天,照射後仍然給予受試物,必要時可延長至45天。
1.3.3 實驗步驟
受試樣品組於照射前後經口連續給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次,照射劑量宜選擇3gy-5gy。分別於照射前、照射後第3天、照射後第14天三次採末梢血20μl,加入0.38ml 1%鹽酸中,混勻後,加入血球計數板中,計算計數池中四個大方格中白細胞總數。
四個大方格中白細胞總數
白細胞數(109/l稀釋倍數 ×107
41.4 資料處理及結果判定
白細胞數為計量資料,採用方差分析,但需按方差分析的程式先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算f值,f值< f0.05,結論:各組均數間差異無顯著性;f值≥f0.
05,p≤0.05,用多個實驗組和乙個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計;對非正態或方差不齊的資料進行適當的變數轉換,待滿足正態或方差齊要求後,用轉換後的資料進行統計;若變數轉換後仍未達到正態或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統計。
照射前的外周血白細胞計數,用於各組間白細胞數目的均衡性檢驗,劑量組與輻射模型對照組比較,差異無顯著性,再進行照射及後續實驗。
照射後3天、14天輻射模型對照組的白細胞數分別與照射前進行自身比較,差異有顯著性,則判定輻射損傷模型成立;任一時間點、任一劑量組與輻射模型對照組比較,白細胞總數增多,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
2.骨髓細胞dna含量或骨髓有核細胞數實驗
2.1原理
骨髓細胞dna含量或骨髓有核細胞數降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現之一,在一定範圍內,照射劑量與骨髓細胞dna含量或骨髓有核細胞數成反比,恢復時間與骨髓細胞dna含量或骨髓有核細胞數成正比,骨髓細胞dna含量或骨髓有核細胞數可代表造血系統受損的狀況。具有輻射危害輔助保護作用的受試物對受輻射損傷機體的造血系統具有防護作用。
2.2儀器和試劑
血球計數板、顯微鏡、注射器、手術器械、紫外分光光度計、hank』s液等。
2.3實驗方法
2.3.1 實驗動物:小鼠,18-22g,單一性別,每組10-15只。
2.3.2劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和乙個輻射模型對照組,以人體推薦量的10倍為其中的乙個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品於照射前給予14-30天,照射後仍然給予受試物,必要時可適當延長至45天。
2.3.3 實驗步驟
受試樣品組於照射前後經口連續給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次,照射劑量宜選擇3gy-5gy。於照射後第3天,頸椎脫臼殺死小白鼠,剝離出股骨,用1ml注射器(6.5號針頭)吸取一定體積的hank』s液,衝出股骨中的全部骨髓細胞;最後,讓細胞懸液通過4號針頭的注射器,使細胞在懸液中充分分散。
鏡下計數每ml骨髓細胞懸液中的有核細胞數。
或用紫外分光光度計260nm處測定dna含量。
2.4 資料處理及結果判定
骨髓有核細胞數或骨髓細胞dna含量為計量資料,採用方差分析,但需按方差分析的程式先進行方差齊性檢驗,方差齊,計算f值,f值< f0.05,結論:各組均數間差異無顯著性;f值≥f0.
05,p≤0.05,用多個實驗組和乙個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計;對非正態或方差不齊的資料進行適當的變數轉換,待滿足正態或方差齊要求後,用轉換後的資料進行統計;若變數轉換後仍未達到正態或方差齊的目的,改用秩和檢驗進行統計。
輻射模型對照組與陰性對照組骨髓有核細胞數或骨髓細胞dna含量進行兩樣本均數的成組雙側t或t』檢驗,差異具有顯著性,則判定輻射損傷模型成立。
任一劑量組與輻射模型對照組比較,骨髓有核細胞數或骨髓細胞dna含量增多,差異有顯著性,則可判定該實驗陽性。
3.小鼠骨髓細胞微核實驗
3.1 原理
骨髓細胞微核數增高是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現之一,在一定範圍內,照射劑量與骨髓細胞微核率成正比,恢復時間與骨髓細胞微核率成反比,骨髓細胞微核數可代表機體染色體受損的狀況。具有輻射危害輔助保護作用的受試物對受輻射損傷機體的遺傳系統具有防護作用。
3.2 儀器和試劑
解剖器械,生物顯微鏡,載玻片等。
小牛血清:小牛血清濾菌後放入56℃恆溫水浴保溫1h進行補體活性滅活。-20℃儲存。亦可用大、小鼠血清代替。
giemsa染液及應用液
1/15mol/l磷酸鹽緩衝液(ph6.8)
甲醇(分析純)
3.3 實驗方法
3.3.1 實驗動物:小鼠,體重18-22g,單一性別,每組10-15只。
3.3.2劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和乙個輻射模型對照組,以人體推薦量的10倍為其中的乙個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品於照射前給予14-30天,照射後仍然給予受試物,必要時可適當延長至45天。
3.3.3 實驗步驟:
受試樣品組於照射前後經口連續給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次,照射劑量宜選擇3gy-5gy。於照射後第3天,頸椎脫臼處死動物,取胸骨或股骨,用止血鉗擠出骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻,常規塗片。或用小牛血清沖洗股骨骨髓腔製成細胞懸液塗片,塗片自然乾燥後,放入甲醇中固定5-10min,放入giemsa應用液中,染色10-15min,立即用磷酸鹽緩衝液或蒸餾水沖洗,晾乾。
鏡檢,每只動物計數1000個嗜多染紅細胞中微核細胞數,微核率以千分率表示。
抑制率計算:
c-da100%
c-e式中 a-抑制率
c-致突變物對照組微核率
d-受試樣品組微核率
e -陰性對照組微核率
3.4 資料處理及結果判定
採用卡方檢驗、泊松分布或方差分析等統計方法進行資料處理。
輻射模型對照組與陰性對照組骨髓細胞微核率進行兩樣本均數的成組雙側t或t』檢驗,差異具有顯著性,則判定輻射損傷模型成立。
任一劑量組微核率低於輻射模型對照組微核率,差異有顯著性,可判定該實驗結果陽性。
4.血/組織中超氧化物歧化酶(sod)活性實驗
4.1 原理
血/組織中超氧化物歧化酶(sod)活性降低是一次性全身γ射線照射引起輻射損傷的表現之一,在一定範圍內,照射劑量與血/組織中超氧化物歧化酶(sod)活性成反比,恢復時間與血/組織中超氧化物歧化酶(sod)活性成正比,血/組織中超氧化物歧化酶(sod)活性可代表機體氧化還原反應系統受損的狀況。具有輻射危害輔助保護作用的受試物對受輻射損傷機體的氧化還原系統具有防護作用。
o2-氧化羥基的最終產物為亞硝酸鹽,後者在對氨基苯磺酸及甲萘胺作用下呈現紫紅色,在波長530nm處有極大吸收峰,可用分光光度法進行測定,當sod消除o2-後形成的亞硝酸鹽減少。
4.2儀器與試劑
儀器 721分光光度計、離心機、恆溫水浴、勻漿器
試劑 65mm磷酸鹽緩衝液(pbs) ph7.8、sod標準品、三氯甲烷、95%乙醇(v/v)、0.9%生理鹽水
10mmol/l鹽酸羥胺
鹽酸羥胺6.95mg,加pbs至10ml
7.5mmol/l黃嘌呤
黃嘌呤11.41mg,加0.1m naoh 2.5ml溶解,加pbs至10ml
0.2mg/ml黃嘌呤氧化酶
取10mg/ml黃嘌呤氧化酶0.2ml加冰冷pbs 9.8ml至10ml
0.1%甲萘胺
取0.2gα-甲萘胺溶於40ml沸蒸餾水,涼至室溫加50ml冰醋酸,再加110ml涼蒸餾水至200ml
0.33%對氨基苯磺酸
取0.66g對氨基苯磺酸溶於150ml溫蒸餾水,加50ml冰醋酸至200ml
4.3 實驗方法
4.3.1 實驗動物:小鼠,體重18-22g,單一性別,每組10-15只。
4.3.2劑量分組及受試樣品給予時間
實驗設三個劑量組和乙個輻射模型對照組,以人體推薦量的10倍為其中的乙個劑量組,另設二個劑量組,必要時設陽性對照組。受試樣品於照射前給予14-30天,照射後仍然給予受試物,必要時可適當延長至45天。
4.3.3實驗步驟
受試樣品組於照射前後經口連續給予受試樣品,劑量組與輻射模型對照組均以同一劑量γ射線全身照射一次,照射劑量宜選擇6gy-8gy。於照射後第7天,進行實驗.
4.3.3.
1紅細胞抽提液製備:10μl全血衝入0.5ml生理鹽水,2000r/min離心3min,棄上清,加冰冷的雙蒸水0.
2ml混勻,加入95%乙醇0.1ml,振盪30s,加入三氯甲烷0.1ml,置快速混合器抽提1min,4000r/min離心3min,分層,上層為sod抽提液,中層為血紅蛋白沉澱物,下層為三氯甲烷,記錄上清液體積待測。
4.3.3.
2組織勻漿的製備:剪取一定量的所需臟器,生理鹽水沖洗、拭乾、稱重、剪碎,至玻璃勻漿器中加入冷生理鹽水20000r/min勻漿10s,間歇30s,反覆進行三次,製成1%組織勻漿,(最好用超聲波發生器處理30s),使線粒體振破,以中性紅-詹鈉氏綠b染色證明線粒體已振碎。以4000r/min離心5min,取上清液20μl待測。
4.3.3.
3 sod標準抑制曲線將sod標準品用磷酸鹽緩衝液配製成750u/ml的溶液,再稀釋到50倍,即sod量為15u/ml(1.5μg/ml),用本法測定不同量的sod標準液的百分抑制率,以百分抑制率為縱座標,以sod活力單位u/ml為橫座標繪製標準曲線。
對照管od-測定管od
sod百分抑制率100%
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