紫外誘變大腸桿菌str(鏈黴素)抗性突變株的篩選
一、目的要求
1 、觀察紫外線對鏈黴素產生抗性的誘變效應
2 、學習並掌握物理誘變育種的方法。
二、基本原理
紫外線的波長在200~380 nm 之間，但對誘變最有效的波長僅僅是在253~265 nm，一般紫外線殺菌燈所發射的紫外線大約有80%是254 nm。紫外線誘變的主要生物學效應是由於dna 變化而造成的，dna 對紫外線有強烈的吸收作用，尤其是鹼基中的嘧啶，它比嘌呤更為敏感。紫外線引起dna 結構變化的形式很多，如dna 鏈的斷裂、鹼基破壞。
但其最主要的作用是使同鏈dna 的相鄰嘧啶間形成胸腺嘧啶二聚體，阻礙鹼基間的正常配對，從而引起微生物突變或死亡。
經紫外線損傷的dna，能被可見光復活，因此，經誘變處理後的微生物菌種要避免長波紫外線和可見光的照射，故經紫外線照射後樣品需用黑紙或黑布包裹。另外，照射處理後的孢子懸液不要貯放太久，以免突變在黑暗中修復。
三、實驗材料
(一) 菌種
大腸桿菌
(二) 培養基（完全培養基）
1. 肉膏蛋白腖培養基
牛肉膏 0.5 g
蛋白腖 1.0 g
nacl 0.5 g
水100 ml
ph7.2
100 kpa 、121℃高壓蒸汽滅菌20min。
如配製固體培養基需加瓊脂1.5%～2%。
如配製半固體培養基則加瓊脂0.7%～0.8%。
(三) 主要藥品
牛肉膏、蛋白腖、nacl、可溶性澱粉、鏈黴素。
(四) 主要器皿
試管30支、移液管1ml10支、5ml3支、10ml1支、錐形瓶10個、量筒、燒杯、培養皿30個、離心管、20 w 紫外燈、磁力攪拌器、離心機、紫外誘變箱等。
四、實驗內容
(一) 誘變
1. 菌懸液的製備
出發菌株移接新鮮斜面培養基，37℃培養16～24h。
取已培養20 h 的活化大腸桿菌斜面一支，用10 ml 生理鹽水將菌苔洗下，取4ml於5ml離心管中離心(3000 r/min)15min，棄上清液，將菌體用無菌生理鹽水洗滌2 次，最後製成菌懸液並倒入盛有玻璃珠的錐形瓶中，強烈振盪10 min，以打碎菌塊製成單菌懸液，用血球計數板在顯微鏡下直接計數。調整細胞濃度為108/ml。
2. 平板製作
將肉膏蛋白腖培養基熔化後，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷卻後，取0.1ml鏈黴素用無菌棒塗佈於平板上。其中留三塊平板不塗佈鏈黴素作為對照。
3. 誘變處理
(1) 預熱正式照射前開啟紫外燈預熱30 min。
(2) 攪拌取製備好的菌懸液5 ml 移入6 cm 的無菌培養皿中，放入無菌磁力攪拌捧，置磁力攪拌器上，20 w 紫外燈下30 cm 處。
(3) 照射然後開啟皿蓋邊攪拌邊照射，劑量分別為5s，10s，15s。可以累積照射，照射完畢先關上皿蓋再關閉攪拌和燈。所有操作必須在紅燈下進行。
4. 稀釋塗平板
在紅燈下分別取未照射的菌懸液(作為對照)和照射過的菌懸液各0.5ml 進行適當稀釋分離。取最後3 個稀釋度的稀釋液塗於肉膏蛋白腖平板上，每個稀釋度塗3 個平板，每個平板加稀釋液0.
1 ml，用無菌玻璃刮棒塗勻，37℃培養48 h(用黑布包好平板)。注意在每個平板背後要標明處理時間、稀釋度、組別。
(二) 計篡存活率及致死率
1. 存活率
將培養48 h 後的平板取出進行細胞計數。根據平板上菌落數，計算出對照樣品1 ml 菌液中的活菌數。
存活率 =處理後1 ml 菌液中活菌數÷對照1 ml 菌液中活菌數
2. 致死率
致死率 =（對照1 ml 菌液中活菌數 — 處理後1 ml 菌液中活菌數）/對照1 ml 菌液中活菌數
3.突變率
自發突變率＝誘變前樣品中str抗性菌數/誘變前活菌數
突變率＝後培養以後樣品中str抗性菌數/後培養以後樣品中的活菌數
同樣計算用紫外線處理5s、10s、15s、後的存活細胞數及致死率。
（三）誘變後培養
1.取1ml誘變處理好的菌懸液接入肉膏蛋白腖液體培養基中進行後培養，37℃120rpm搖瓶避光培養；
2.對後培養的菌懸液進行平板菌落計數。
（四）菌株的篩選
1.將經過誘變後培養的菌懸液適當稀釋後，分別塗佈於含最小抑制濃度的鏈黴素培養基平板上，37℃培養長出的菌落即為鏈黴素抗性突變株。
2.計抗性菌落數，計算誘發突變率，觀察紫外誘變的效果。
五、實驗資料記錄與處理
（一）將實驗結果按表要求如實填入，並分別算出存活率，致死率。
表1 紫外線處理後枯草芽孢桿菌的存活率及致死率對照組
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